フォトニック結晶により蛍光発光と点滅抑制を強化し、単一量子ドットのデジタル解像度バイオセンシングを実現

Nature Communications volume 13、記事番号: 4647 (2022) この記事を引用

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15 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ナノスケール量子エミッターは生体分子の相互作用を測定するための効果的なタグですが、単一ユニットの観察を必要とするアプリケーションでのその有用性は、大きな開口数 (NA) の対物レンズ、蛍光断続性、および全方向放射による貧弱なフォトン収集効率の要件によって制限されます。今回我々は、励起の強化、指向性の高い抽出、量子効率の向上、フォトニック結晶（PC）表面を通じた瞬きの抑制の相乗効果によって達成された、ほぼ3000倍の信号増強を報告する。このアプローチでは、低 NA レンズと安価な光学セットアップを使用している場合でも、高い S/N 比を備えた単一量子ドット (QD) 感度が実現されます。 PC の点滅抑制機能により、QD のオン時間が 15% から 85% に改善され、信号の断続性が改善されます。私たちは、単一分子分解能、単一塩基変異選択性、および 10 アトモルの検出限界を備えた、がん関連 miRNA バイオマーカーのアッセイを開発しました。さらに、がん特異的な miRNA 配列の単一塩基を変更することによって QD の表面結合のストリンジェンシーが変化すると、量子ドットの異なる表面運動軌跡が観察されました。

化学およびナノ粒子ベースの蛍光レポーターは、ライフサイエンス研究および分子診断のコンポーネントとして広く利用されています。光子生成タグを使用すると、レポーターを標的分子に結合し、続いて光子放出を光センサーに収集しながら蛍光を励起する機器で検出することにより、生物学的分析物の視覚化と定量が可能になります。コロイド量子ドットは、大きな吸収係数（>107 M–1 cm–1）、狭くて幅広く調整可能な発光バンド、高い光安定性、高い量子効率など、単一分子の読み出しによるデジタルアッセイに幅広い有用な光学特性を提供します。プラズモニック表面とナノ構造による局所的な電磁場強度の増強による蛍光レポーターの強化は、生体分子アッセイ 1、2、3、4、5、6、特に多くの蛍光団の凝集体を検出するアッセイで検出限界の低下を達成するための効果的な戦略であることが証明されています。、その発光が組み合わされて、バックグラウンド蛍光や光検出器のショットノイズを超えて検出可能な信号が生成されます7、8、9、10。一般的なアッセイ戦略には、多数の蛍光団を一緒に凝集させること (マイクロアレイスポットなど)、または酵素増幅を利用して単一の分析物から大量の蛍光レポーターを生成することが含まれます。

近年、単一蛍光レポーターの励起を強化し、それらの光子放出を効率的に収集し、さまざまなノイズ源の存在下でそれらを観察できるようにするシグナルを生成するという問題に多くの研究が取り組んでいます。たとえば、全反射蛍光 (TIRF) 顕微鏡では、高価な高 NA 油浸対物レンズと電子増倍電荷結合 (EM-CCD) カメラを使用して単一蛍光団の解像度を達成し、信号対数を 30 倍以上増加させることができます。 -ノイズ比11、12。プラズモニックナノ構造13、14、15、16、17、18は、〜100〜〜1000の蛍光増強係数による電場励起強度の局所的増強に成功していることが証明されているが、多くのプラズモニック構造は高い非ノイズ比に悩まされている。金属の固有損失、消光、および放出された光子の方向性の低さによる放射減衰16。さらに、そのようなナノ構造の共鳴波長は、ナノ共振器のサイズ、形状、および材料によって固定される。誘電性光マイクロキャビティを用いて蛍光レポーターを励起するための初期のアプローチは、中程度の発光速度の向上を実証しています19、20、21。誘電体マイクロキャビティの制限の 1 つは、キャビティの高 Q 共振と、室温で不均一に広がった蛍光発光体からのスペクトル的に広い発光との間の不一致です。プラズモニックと誘電体のハイブリッドナノギャップと誘電体ナノワイヤスラブによる電磁場強化の最近の報告 22 では、これらの問題に対処し、最大 1000 倍の強化を示していますが、全表面のごく一部のみをまばらに占める高度に局所的なホットスポットが少数あります。エリア。それにもかかわらず、高度なナノ加工を通じてこのような高い増強係数を達成するには、蛍光エミッタとキャビティモードの間の正確な位置合わせが必要である。これらの問題を克服するために、私たちの以前の研究では、PC表面から広範囲の表面積にわたって蛍光を増強するための顕微鏡ベースのアプローチを使用しました。 1 次元 PC23 上の Cy-5 結合ストレプトアビジン層からは、蛍光強度が 60 倍増加することが報告されています。この強化は、金ミラー反射板を介して PC リーキーモードを基礎となるファブリーペロー型キャビティに結合することによって 360 倍に改善できます 24。 2 次元 PC 表面からのリーキーモード支援蛍光抽出を使用することにより、QD 層の 108 倍の蛍光増強が報告されています 25。より最近では、Yan ら。は、100 倍を超える広帯域蛍光増強を達成するための超広帯域阻止帯域を備えたマルチヘテロ構造 PC を実証しました 26。これには、自己組織化 2D コロイド結晶単層の複雑な層ごとの製造が必要でした。三次元 PC 構造も蛍光を増強するために使用されています。ソングら。 PMMA 球の多層で構成される 3D オパール PC 上に Ru 色素層をスピンコートし、デュアルストップバンド構成で約 320 倍の発光増強を達成しました 27。

現在、いくつかの重要なクラスの低濃度がんバイオマーカー (タンパク質、循環腫瘍 DNA、長鎖非コード RNA、脂質、代謝産物) が熱心な研究活動と臨床検証のテーマとなっていますが、ここでは循環マイクロ RNA (miRNA、 miR）。リキッドバイオプシーの顕著な増加に伴い、miRNA は有望な臨床癌バイオマーカーとして機能する可能性があり、miRNA 濃度と特定の癌の種類や転移状態などの特定の健康状態との相関関係を示す研究が多数あります 28、29、30、31。ヒト血清から miRNA バイオマーカーの濃度を高感度かつ定量的に頻繁に測定できる可能性は、がんの早期発見、治療モニタリング、予後、治療結果の予測に向けた一歩となり、安価でシンプルな高性能の製品の必要性がさらに強調されます。アッセイ32．私たちの取り組みなどにより、戦略的に選択された循環 miRNA バイオマーカー濃度が臨床転帰に関連しているという証拠が得られました。たとえば、血漿エキソソームの RNA 内容を配列決定することにより、我々のチームは、去勢抵抗性 (mCRPC) 発症時の転移性前立腺がん患者の臨床転帰と強く関連する 2 つの miRNA、miR-375 および miR-1290 を発見しました 33。 RNA シークエンシング (高度な機器、大量のサンプル量、および精巧なサンプル処理を必要とする) を必要とせずに、非常に低濃度で単一塩基の識別で miRNA を検出することは、現在の臨床現場で満たされていない重要なニーズを表しています。

残念ながら、全血 RNA の単離と精製に続いて定量的逆転写酵素 PCR (qRT-PCR) による標的同定を行う標準プロトコールは、多大な労力を要し、酵素による増幅が必要であり、配列バイアスが生じる可能性があります 34, 35。実際には、qRT-PCRアッセイでは、短い miRNA 標的配列に対して独自のプライマーと増幅方法が必要なため、少量の分析には失敗します 36。一方、シークエンシングベースのアプローチ (RNA-Seq) は、精巧なサンプル処理、高価な機器、長い待ち時間、およびバイオインフォマティクスの専門知識を必要とします。これらはすべて使用を制限します。 qRT-PCR37 の場合、高感度は酵素増幅によって達成されますが、精度のためには DNA への変換 (逆転写) と酵素増幅の完了の両方が必要です。デジタル液滴アプローチにより、少量の生体試料の定量分析が大幅に改善されました。しかし、同様の課題により、液滴フォーマットでの miRNA の qRT-PCR アッセイの読み取りが制限され、液滴分配の低スループット、装置コスト、狭いダイナミックレンジ、および複雑なデータ分析ステップによってさらに悪化します。電気化学センサーは、超高感度 (<1 pM) 38 で、簡単な読み出しによる増幅不要の miR 検出が可能 39,40,41 ですが、動作温度範囲が制限されています 42。それにもかかわらず、低濃度で類似した配列の核酸を効果的に識別するには、超高感度で標的特異性の高い分子診断検査を開発することが必要である。さらに、酵素増幅を必要としない診断アッセイは、ポイントオブケアでの使用に望ましい。迅速で費用対効果の高い診断の開発は、幅広いポイントオブケア設定で臨床応用のための技術を普及させるために不可欠です43。

この研究では、光学的に強化された高い信号対雑音比で個々の分子のデジタル分解能を提供することにより、癌特異的な miRNA 標的を高度に特異的に検出するためのセンシング戦略を紹介します。全体として、品質係数エンジニアリングにより、電磁シミュレーションによってサポートされた実験的特性評価を使用して、個々の QD タグから検出された光子強度の最大 3000 倍の向上を達成しました (パターンのない平坦なガラス表面での QD の検出と比較して) 23 倍のゲインに帰属します励起の強化には 39 倍の利得（光子抽出率の向上とパーセル効果による量子効率の変化の両方を含む）、抽出の強化には 39 倍の利得、収集効率の強化には 3.5 倍の利得が得られます。さらに、PC の瞬き抑制機能により、QD オンタイムが 15% から 85% に向上し、単一粒子レベルでの高速モーション追跡を容易にしながら、超高感度測定中に発生する信号断続性の問題を改善する方法が提供されます。ここでは、これらの相乗特性を利用することにより、PC-QD システムが、TIRF や高解像度を使用せずに、低 NA レンズ (NA = 0.5、50 倍) を使用して、高い S/N 比 (約 59) の単一 QD 感度を達成できることを示します。ゲイン電子増倍カメラ。個々の量子ドットからの励起、抽出、放出速度、および収集効率を向上させるための物理原理の探求は、少量の臨床サンプル中のがん関連バイオマーカーを検出するための、より高感度で定量的かつ簡単な方法を開発したいという願望によって動機づけられています。この研究のさらなる側面は、デジタル解像度の生体分子アッセイにおける単一量子ドットイメージング機能の利用であり、他の miRNA や DNA およびタンパク質の検出に適応できる miRNA バイオマーカーの高感度かつ選択的な検出を実現しています。このレポートでは、PC-QD システムを利用して、45 μL のサンプル量から特異性の高い 2 ステップの室温 miRNA アッセイを実行し、個々の標的分子のデジタル分解能を提供します。その結果、単一塩基で最大 10 aM の検出限界が得られます。 -ペア不一致選択性、および高いダイナミックレンジ（9桁）。興味深いことに、単一粒子追跡における点滅抑制機能を利用することにより、我々のイメージングシステムは単一量子ドットの動的軌跡を記録することができ、これにより、洗浄ステップなしで10分間で標的miRNA分子の単一塩基の違いを識別することができる。シンプル、高感度、定量的、そして少量の miRNA 検出に関する当社の戦略は、ポイントオブケア診断の臨床ニーズによって決まります。多段階の酵素増幅に固有の非線形性を回避するために、QD タグと PC 表面を使用したシングルエンドポイント光学検出を使用して、個々の表面に付着した QD の高 S/N イメージングを容易にし、miRNA を直接計数できるようにします。

PC 表面による量子ドット (QD) 強化に関する以前の報告 1 を超えて、私たちの現在の目標は、簡単な低コスト製造で QD タグの蛍光顕微鏡用の汎用の巨視的基板として機能できる、新しく設計された PC ナノ構造表面を構築することです。プロセスを強化し、強化係数を大幅に向上させました。図1a、bに示すように、量子ドットの発光強度を3000倍に高めることができる機器を設計し、低NAの対物レンズ（NA = 0.5、50倍）を使用して単一の量子ドットをイメージングする機会を広げました。油浸高 NA レンズ (通常 NA ～ 1.46) と洗練された TIRF 装置。放射エンジニアリングによって、はるかに大きな強化が達成されます。放射工学では、放射 (Qr) と非放射 (製造上の欠陥によって引き起こされる吸収または避けられない損失、Qnr) の 2 つの品質係数を正確に調整して相互に一致させます。理論的限界に向けて増強係数を最大化するには、2 つの PC 共振モード (ポンプモードと蛍光モード) に対して Q マッチング要件 (Qr = Qnr) を満たす必要があります。この 3000 倍の増強は、蛍光生成プロセス (吸収、励起状態寿命、放射蛍光放出) から収集プロセス (遠視野分布および瞬きの減少) に至るまでの包括的な増強を提供するための乗算増強係数の統合によるものでもあります。 ) 放出光子が生成された後。

a ブリッジアッセイ設計と、微細な Z セクション化および点滅抑制を備えた 3000 倍の蛍光増強を利用した PC-QD 共鳴増強 miR デジタル計数検出アプローチの概略図。 PC-QD 強化 miRNA デジタル診断のコンポーネントが上部に示されており、ssDNA プローブ (青色) は、約 10:1 の比率で QD-ストレプトアビジン表面上で官能化されています。 NUPACK シミュレーションに基づいて、キャプチャ鎖 (黄色) の長さは 10 塩基 (ターゲットの下部とペア)、プローブの長さは 12 塩基 (ターゲットの上部とペア) に設定されます。ターゲット miRNA 375 (ピンク) とのダブルハイブリダイゼーションのための 22 塩基の相補ペア。ブリッジ活性化アッセイプロセスでは、ターゲット miRNA が表面結合複合体を形成するときに、QD タグが PC 表面に引き下げられます。 b 表面捕捉量子ドットは、自由浮遊非捕捉量子ドットと比較して 3000 倍の増強を経験します。強力な増強係数により、NA = 0.5 の対物レンズのみを使用して単一 QD イメージングが可能になります。 PCEF ラインスキャン画像の例を左側に示します。 EMCCD カメラ (浜松) を使用して、ゲイン = 1、感度ゲイン = 100 (EM ゲイン 1200 倍中 40 倍)、積分時間 = 600 ミリ秒でキャプチャされた画像。レーザー出力 = 1 mW。対物レンズ：×50、NA＝0.5。 PCポンプモード：オンレゾナンス。回折限界のスポット強度の時間トレース (右) は、特徴的な 2 レベルの強度分布によって単一 QD を識別するために使用されます (対物レンズ: ×50、NA = 0.5)。 c 強化された励起場の図。赤い矢印は QD 発光を示します。 d 抽出率と回収効率の向上の図。オレンジ色の領域は、ガラスと PC 上の QD 発光の空間分布を示しています。 PC 内の黄色のハイライトは、その蛍光モードのモードプロファイル分布を示します。 QD で放出された光子は、まず PC の蛍光モードに結合され、対物レンズ (ライトグレー) の集光範囲に含まれる設計された角度で、より高い抽出率で遠視野に再放射されます。 e 自然発光率の向上と瞬きの抑制の図。

光と蛍光 QD タグとの相互作用は、光共鳴の存在下で次の 5 つのメカニズムを通じて劇的に変更できます 25、44、45: (i) 励起ポンプ場を共鳴モードに結合することによる分子の吸収 (励起率) の増強バルク吸収による（図1c）、（ii）自由空間に置いた場合と比較して、PCの存在下で生成された光子の遠方場への抽出率の向上（図1d）、（iii）自然放出の向上非変更環境と比較してエミッターのフォトニック環境を変更することによる速度と放射量子効率46（図1e）、（iv）放出された光を好ましい出力結合方向に向け直すことによる収集効率の向上（図1d）、および(v) 点滅の抑制 (図 1e)。まず、PC はレーザー照明の波長で共鳴光ポンプモードをサポートし、表面付着量子ドットを励起するための増強された電磁場を生成するように設計されています。強化された励起メカニズムにより、PC 表面近傍内の量子ドットのポンプエネルギーの実質的な吸収が可能になり、パターンのないガラス表面に接触する同じ量子ドットよりも多くの光子が生成されます。第二に、QD 放射光は PC 蛍光モードと結合し、より高い抽出率で遠視野に放射するため、単一の画像統合時間中により多くの光子が捕捉されます。第三に、誘電体 PC はパーセル効果によって量子効率の向上をもたらし、その結果、自然放出寿命が短縮され、量子効率が向上します。第 4 に、PC 共振モードは、自由空間における指向性の高い光子の角度分布を決定する光子の分散を提供します。指向性放出機構により、既知の QD 放出波長の角度を NA に組み込んだ顕微鏡対物レンズを戦略的に選択することで、PC からの光子収集効率が向上します。さらに、PC 上に QD が存在すると、QD の点滅が抑制され、QD が時間の大部分で「オン」状態のままになることを示します。現在の研究の重要な要素は、PC 表面を利用して、点滅抑制を伴う前例のない 3000 倍の QD 発光増強を達成する、いくつかの独立した乗算効果の組み合わせにあります。これにより、高い NA を維持しながら、低い NA 対物レンズを使用して個々の QD を観察できるようになります。信号対雑音比、広い視野、信号断続性の問題の改善。

PCが励起レーザーの波長でポンプ共鳴モードをサポートすると、励起の強化が発生し、局所的な電場が強化されます（図1c）。 PC-QDシステム（補足図S1a〜eを参照）は、誘電体PCスラブの表面に生体分子結合でリンクされたQDで構成されています。図 2a は、PC-QD システムの代表的な走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像を示しています。 PC スラブは、周期的に変調された SiO2 基板 (n = 1.46) 上の Si3N4 薄膜 (n = 2.05) コーティングでフォトニック結晶誘導共鳴 (PCGR) をサポートします。表面を水性媒体に浸し、横電気偏光 (TE) 偏光レーザー (λlaser = 450 nm) を入射角 θ で裏側から励起します。レーザー入射角が PC の位相整合条件を満たすと、一次ブラッグ散乱 47 を介して伝播導波モードとして結合されます。次に、励起光は、共鳴支援輸送経路を通って PC 内を伝播し、有限の寿命 τ の間、PC の上面に沿って閉じ込められる「漏洩固有モード」を形成し、調整可能なローレンツ線形共鳴を伴います。周波数領域19。入射光からの連続入力エネルギーにより、PC は光子エネルギーを蓄積する共鳴光空洞として機能します。その結果、局所的な励起場はパターンのない通常の表面よりも数桁大きくなる可能性があり（図2b）、その結果、表面に取り付けられたQDの吸収が強化される可能性があります48。共鳴時には、表面近くに強い近接場強度が蓄積され、共鳴モードはエバネッセント場の尾部を通って巨視的表面全体に広がります（図1c）。この非局在化特性により、Z 方向 (<100 nm、微細な Z 断面) 内で、PC の広い表面積 (X-Y 平面内) のどこにでも、追加された QD タグと簡単に相互作用できるアプローチが開かれました。

PC-QD結合システムの倍率40kのSEM画像。スケールバー、1 μm。左の挿入図は、100 nm のスケールバーを使用して 130k の倍率で拡大した詳細領域を示しています。右の挿入図は、倍率 600k での QD-605 の TEM 画像を示しています。スケールバー、10 nm。 3 つ以上の実験が独立して繰り返され、同様の結果が得られました。 b PC 断面の近接場強度分布の FDTD シミュレーション。オン共振 (θ = 9.2°、左) とオフ共振 (θ = 20°、右) の両方。 c 強化蛍光モード (緑色) およびガラス上単独モード (青色) と組み合わせた場合の QD-605 の角度分解発光スペクトル測定 (両方とも集光角 = 26°)。 d 上のパネル: PC 表面上の位置の関数としてのパーセル強調係数 (Fp) 2D マッピングの数値シミュレーション。単一の双極子が使用され、x 方向に配向されていると想定されます。下のパネル: 原子間力顕微鏡 (AFM) を使用した PC 表面のトポグラフィックイメージング、x = 1.13 μm、y = 0.4 μm、Z 高さの範囲は 0 nm (溝) から 28 nm (リッジ) です。 e PC 表面 (青の曲線) とガラス (赤の曲線) からのシミュレートされた遠方界放射パターン。白い領域は、NA = 0.5 によって収集された角度領域を表します。 f 角度分解した PC 反射スペクトル (バンド構造) のシミュレーション。

QD (平均半径 ~ 4 nm) とポンプ共振モードの間の空間的な重なりは通常、波長に比べて小さいため、励起エネルギーのごく一部のみが吸収されます 45。ここで、量子ドットの単一層によって吸収される電力を \({P}_{{{\rm {Glass}}}}^{{{\rm {abs}}}}=\left({N}_ {0}{\sigma }_{{{\rm {QD}}}}d\right)\times {P}_{{{\rm {in}}}}\)、ここで σQD は吸収交差です。分子の断面、N0 は分子の数密度、d は QD 単層の厚さ、Pin は励起ポンプパワーです。時間結合モード理論 (TCMT) モデル 20、21 から、励起増強係数を次のように定義します。

比率項 \({({Q}^{{\rm {P}}})}^{2}/{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}} \) は、ポンプ共鳴モードを通じて光共鳴にどれだけの入力励起エネルギーが蓄積されるかを表します。エネルギー閉じ込め係数 \({\alpha }^{{\rm {P}}}={\int }_{{\rm {QDlayer}}}{|{{{{{{\bf{E} }}}}}}_{{{{{{\bf{k}}}}}},{\オメガ }_{{{{{{\bf{k}}}}}}}^{{ \rm {P}}}({{{{{\bf{r}}}}}})|}^{2}{\rm {d}}{{{{{\bf{r}}}} }}\) \({{{{{{\bf{E}}}}}}}_{{{{{\bf{ k}}}}},{\omega }_{{{{{{\bf{k}}}}}}}}^{{\rm {P}}}({{{{{\bf{ r}}}}}})\) は、ポンプレーザーからの正規化された電場です。レーザーは基板の底部から入射するため、ここで下向き放射品質係数は \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {P}}}={Q }_{{\rm {r,tot}}}^{{\rm {P}}}\cdot \frac{{S}^{{\rm {P,tot}}}}{{S}^{ {\rm {P,down}}}}\)、ここで \({S}^{{\rm {P,down}}}\) は下向きの放射束、\({S}^{{\rm {P,tot}}}\) は総放射線束です。

2 番目のメカニズムは、ファノ共鳴の存在下でのスペクトル状態密度 (SDOS) の強力な変更による抽出率の向上です。量子ドットのスペクトルおよび角度発光は、巨視的なナノ構造の共鳴と結合すると、自由空間での場合と比べて劇的に変化する可能性があります。図2cに示すように、蛍光スペクトルに鋭いスペクトル特徴が観察されます。同様に、QD 蛍光共鳴と組み合わせた場合の抽出増強係数を、PC の存在下での遠方界への抽出率の比として定義します (\({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\times) \frac{{Q}^{{\rm {F}}}}{{Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}}\)) のレートとの比較空き容量 (\({\varGamma }^{{\rm {free}}}\)):

ここで、\({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\) と QF は、代表的には QD 蛍光チャネルの放射品質係数と総品質係数です。係数 \({\varGamma }^{{\rm {PC}}}\) は、以前の研究 45 で、分子の均一かつ等方性の集合が共鳴周波数 ωk で結晶運動量 k を持つ光子を生成する速度として定義されました。 CE 計算の後半で下向き放射率を考慮するため、下向き放射品質係数の代わりに合計放射品質係数を使用します。

さらに、ニアフィールド共鳴は、そのファーフィールド特性と直接相関しています。遠視野では、PCGR 輸送経路が直接の背景反射を強めに干渉し、共鳴波長で反射ピークが生じることを発見しました。 PC バンド図の反射スペクトル (図 2f) を検査すると、ポンプモードの適度な品質係数で PC を設計します (\({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm { P}}}=\frac{{\lambda }_{0}}{\varDelta \lambda }\約 130.19{{{{{\rm{@}}}}}}450\,{{{{{\ rm{nm}}}}}}\)) 9.2°で入射したレーザーが QD 励起波長と一致する場合。補足図S2は、PCがQD励起波長でポンプモードのオン共鳴（薄緑色の星）およびオフ共鳴（深緑色の点）であるときのシミュレートされたPC反射スペクトルを示しています。実験的に測定された PC 反射スペクトルは、QP ≈ 106.41 で重ねられた灰色の点としてプロットされています。同様に、図1cでは、QD発光スペクトルがPCGR結合蛍光モード（緑色）と非共役発光（青色）で比較されています。品質係数 \({Q}_{{\rm {r}}}^{{\rm {F}}}\約 225.08\) (シミュレーション設計) および λQD = 605 nm での QF ≈ 115.87 (実験測定) 。さらに、単一のQD-605のコアシェル構造は、透過型電子顕微鏡（TEM）を使用して明確に分解され（図1a、挿入図）、平均半径は約4 nmと測定されました（補足図S7）。 PC 格子表面の上に 4 nm の厚さの QD 層があると仮定すると、理論上の励起係数と増強係数は \({\Lambda }_{{{\rm {励起}}}}\約 21.84\) および \({ \Lambda }_{{{\rm {抽出}}}}\約 34.39\) (補足パート 4 を参照)。

QDから放出された光子がPC抽出モードと結合し、より高い出力結合速度で遠方場に漏れ出す前に、自然放出のプロセスも変更されます（図1f）。近接場強化と状態密度の増加により、PC の表面に配置された QD の自然放出率も向上します。このパーセル効果は、誘電体材料の無損失特性により非放射減衰率を増加させることなく量子効率 (QE) を変更することで QD 発光を強化します。 PC (QEPC) 上の QD-605 の強化された量子効率は、次の方程式を使用して推定できます。

ここで、γrad,PC、γnonrad,PC、および γloss,PC は、PC 表面上の QD の放射率、非放射率、および損失率です。 PC 誘電体システムは追加の損失チャネル (γloss,PC = 0) を生成せず、固有の非放射減衰率 (γnonrad,PC = γnonrad,i) を変更しないと仮定します。

図 2d の上部パネルは、PC 表面上の位置の関数としてシミュレートされたパーセル強調係数 (Fp) の 2D マッピングを示しています。 Fp は、ガラス上の元の放出率と比較した、修正された自然放出率の変更の相対比率によって計算されます。下のパネルの AFM 画像に基づいて、パーセル係数 2D マッピングを PC 格子表面のトポグラフィー構造に合わせます。 QD が PC 蛍光モードと共鳴すると、リッジ領域は溝よりも高いパーセル増強を提供し、格子エッジで最大値に達します。この誘電体 PC システムは理論的には自然放出率 \({\gamma }_{{{\rm {SP}}}}^{{{\rm {PC}}}}\) を相対的に 3 ～ 5 倍高めることができます。パターンのないガラスの元の放出率 \({\gamma }_{{{\rm {SP}}}}^{0}\) に戻ります。

さらに、強化された蛍光は、近接場相互作用を通じてPCGRモードに結合し、自由空間に放射されて顕微鏡の対物レンズによって収集されることができます（図1d）。 PCの分散バンド図（図2f）は、放出された光子がどのように顕微鏡の対物レンズに向けて好ましい方向に向けられるかを示します（収集効率の向上）。当社のシステムでは、PC は 25.8°で 605 nm 発光の分散角を提供するように精密に設計されており、限られた開口数 (NA = 0.5 対物レンズの場合は 30°) 内で抽出された発光が確実に発生します。

QD 出力結合の遠方界放射パターンと収集効率は、有限差分時間領域 (FDTD) 法を使用して計算されます (補足パート 6 および 7 を参照)。図3dの青と赤の曲線は、それぞれPC基板とガラス基板の両方上のQDの遠視野放射分布を極表示で示しています。収集効率の向上を定量化するために、パラメーター \({{\rm {CE}}}=\frac{{S}_{{{\rm {col}}}}}{{S}_{{{ \rm {tot}}}}}\) は、顕微鏡の対物レンズに入る収集されたパワー (Scol) と、単一の分子によって放出される合計パワー (Stot) の比として表されます。シミュレーション結果 (補足パート 6 を参照) は、NA = 0.5 の対物レンズを使用して下からの発光を収集する場合、収集効率 (CE) が 5.19% (ガラス上) から 18.21% (PC 上) に 3.51 倍向上することを示唆しています。放射パターンの角度分布とその指向性を調べるために、対物レンズの後焦点面 (BFP) で単一 QD 放射分布を画像化しました。図3dの2つの挿入図は、実験記録（青色のカラーバー）と数値シミュレーション（赤色のカラーバー）の両方を二重双曲線形状のバンドとして示しています。主要な図の青い点は、実験的に測定された正規化されたパワー分布を集光角と開口数限界の両方の関数として示しています。図3dの赤いトレースは、数値シミュレーションが実験データと著しくよく一致していることを確認しています。 QD-605 の発光 (FWHM = 28 nm、補足情報を参照) は、主に 25.8° を中心とした 2 つのローブに限定され、角度分布の半値全幅は 9.2° です。

a 励起効果を高めるための実験結果。ポンプモードのみの PCGR 強化条件 (左) および非強化条件 (右) での拡大単一 QD 画像。増強係数は、バックグラウンド補正後の \({\Lambda }_{{{\rm {励起}}},{\exp }}\)= (IE−I0)/I0 によって計算されます。IE は単一 QD 強度です。 PC ポンプモードがオン共振の場合、I0 は PC ポンプモードがオフ共振の場合の単一 QD 強度です。 QD は常に PC の表面上にあるため、抽出、QY、収集効率による向上はどちらの場合でも同じです。 b 抽出率と量子効率 (QE) 効果の向上に関する実験結果。強化された抽出率と QE 効果の両方の強化された条件 (左) と強化されていない条件 (右)。レーザー入射角：20°。ポンプモードの共振がオフになっています。 NA = 1.46、油浸対物レンズを使用する場合、収集効率の向上は無視できます。 c アンサンブル量子ドットの TRPL 測定は、ガラス上 (黄色) と PC 上 (青色) での減衰時間を平均しました。 \({\chi }^{2}\) の値は、カーブフィッティングの品質を保証するために <1.2 です。 d BFP 画像と発光の角度分布。単一の QD-605 の理論 (赤) および測定 (青) 角発光強度 (中心は 604.4 nm、FWHM 範囲は 590.4 ～ 618.4 nm)。挿入図: 単一 QD の後焦点面の理論上の画像 (赤、NA = 1) と実験的に測定した画像 (青、NA = 0.8、空気中)。 2 本の垂直破線は、対物レンズの最大集光角を示します (NA = 0.5 および NA = 0.8)。 e PCGR モードと組み合わせた QD の点滅抑制。時間トレース (左パネル、青)、2 つの異なる状態の強度ヒストグラム (中央パネル、青)、およびオン/オフ時間の確率分布は、PC 上の QD のべき乗則に従います (右パネル、青)。 f ガラス面上の QD の場合は点滅します。時間トレース (左のパネル、黄色)、2 つの異なる状態の強度ヒストグラム (中央のパネル、黄色)、およびオン/オフ時間の確率分布は、PC 上の QD のべき乗則に従います (右のパネル、黄色)。積分時間: 100 ms、対物レンズ: ×100、NA = 1.46、オイル排出。レーザー出力 = 2.1 mW。 PCポンプモード：オフレゾナンス。 4 つの分布はすべて次のべき乗則に従います: \({P}_{(t)}\propto {t}^{\alpha }\)、ここで \({\alpha }_{{{\rm {on}}} PC 上の QD の場合、}\) = −0.98 および \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −1.71。 \({\alpha }_{{{\rm {on}}}}\) = −1.63 および \({\alpha }_{{{\rm {off}}}}\) = −0.95 (QD オン)ガラス。

単一分子デジタルセンシングは、検出可能な各シグナルの二値決定を可能にするだけでなく、低濃度（サブナノモル）分析物の離散計数によって定量的情報の検出限界を拡張します49。 PC 増強蛍光 (PCEF) 顕微鏡の単一分子検出能力と実験増強係数を調べるために、PC を共鳴条件で照明しながらラインスキャン実験を実行しました。レーザーラインは個々の量子ドットの離散的なセットと交差しており、背景の上ではっきりと観察できます。具体的には、PCEF顕微鏡セットアップの概略図を補足図S3に示します。ここでは、半波長板がPCに対して垂直に配向されたコリメート青色レーザーダイオード（TE、450 nm、1〜5 mW）の主偏光を回転させます。直線偏光子通過後。入射ビームはシリンドリカルレンズによって集束され、ラインプロファイルに集束され (zx 平面でコリメートされながら zy 平面で集束)、対物レンズの後焦点面 (BFP) に位置合わせされます (×50、NA = 0.5）。右下隅の部分図（SI、図S3）は、フーリエ変換を通じてBFP上の焦点線を平行移動（Δx変位）することにより、入射角θincがどのように正確に調整できるかを示しています。 PC は電動サンプルステージに取り付けられており、レーザーラインに対して垂直に移動してラインスキャンを実行します。位相整合条件からの入射角選択ルールにより、フォトニック共振器 (PC-QD 結合モード) とパターン化されていない基板 (孤立 QD) の両方における近接場分布、励起強度、および QD 増強放出を直接比較できます。

その後、各回折限界の発光位置が時間領域の強度変動を分析することによって検査され、発光が QD 集合体からではなく単一 QD から生じていることが実証されます。我々は、PCマルチエンハンスメントがQD発光信号の増幅に関与していること、およびシステムが単一QD点滅の特徴的なバイナリ発光シグネチャの観察を通じて単一QD検出限界を提供することを実証します。図 1b は、オンレゾナンス PCGR モードをサポートするために正確に調整された入射角 (精度約 0.025°) を備えた自家製倒立走査顕微鏡 30 を使用した、120 µm × 120 µm の PC 表面にわたる強化されたライン走査 QD イメージングを示しています。入射ビームは、PC 表面 (回折格子に垂直) 上の x 軸に沿って配向されたライン (1.5 μm × 0.5 mm) に集束され、y 軸に沿って走査されます。自動角度走査テストは、テスト領域内の正確な共鳴角度を確認し、角度に敏感な励起の強化を保証するために実行されます。

単一QDイメージングの励起増幅率を、PCGR増強ケース（ポンプモードオン共振、図3a）と非増強ケース（ポンプモードオフ共振、図2b、θ = 20°）の両方で比較しました。 \({\Lambda }_{{{\rm {excitation}}},{\exp }}\estimate\) 23.14 (個々の QD のサンプルサイズ) の実験で分解された平均増強係数は、前のシミュレーション結果と一致します。セクション。図3aの挿入図は、同じポンプモードの非強調画像の線形コントラスト強調画像を示しています。 PC からの励起強化がなければ、同じ励起パワー (1 mW)、対物レンズ (NA = 0.5)、および CCD 積分時間 (0.6 秒) を使用して、相対的にノイズの多い背景上の QD 信号を明確に分解することはできません。私たちのシステム。これらの結果は以前のレポート50、51を超えており、低NA対物レンズ（以前のレポートでは1.4〜1.46と比較してわずか0.5）とPC表面から複数の強調を備えた通常の倒立顕微鏡を使用して単一QDを観察できることを示しています。単一分子結合相互作用は、QD 点滅現象を利用することによってさらに特徴づけられています 50、52、53、54。時間領域の強度トレース（図1b）は、100ミリ秒の積分時間でレーザーラインを固定位置に保ちながら収集された一連の画像について記録されました。ピクセル強度は、単一の回折限界の明るいスポットの平均値 (16 ビットの生データ) によって計算されます。 2 つの異なる強度状態 (IQD と IB) は、発光のオンオフ断続性により明確に区別でき、固有の QD 強度と全体的なバックグラウンドに対応します。 QD 信号とバックグラウンド間の大きなギャップは、信号対雑音比の驚異的な向上によるものであると考えられます (SNR = \(\frac{\left|{I}_{{{\rm {QD}}}}-{I} _{{\rm {B}}}\right|}{{\sigma }_{{{\rm {noise}}}}\)、PC 表面強化によって提供される <1 から 59.31) に増加しました。

抽出速度と量子効率の強化は PC 表面にある QD に常に存在するため、実験的な強化係数 (\({\Lambda }_{{{\rm {extraction}}},{\exp }) を調べます。 }\) および \({\eta }_{{{\rm {QE}}}}=\frac{{{{\rm {QE}}}}_{{{\rm {pc}}}} {{{{\rm {QE}}}}_{0}}\)) 量子ドットが PC 上にある場合 (ポンプモードがオフ共振である場合) とガラス表面上にある場合の単一 QD イメージングを比較します。ガラス表面上の単一量子ドットを観察するために、より大きな NA (1.46、油浸、×100、Zeiss α Plan-APO-CHROMAT) とより高いレーザー入力パワー (2.1 mW) が使用されます。図 3b は、PC (左) とガラス (右) 上に単一 QD を配置した場合の、強化された抽出と強化された QY から得られた単一 QD 発光の差の比較を示しています。ここでは、PC からの強化された励起効果を除去するために、レーザーは 20° の角度 (ポンプモードのオフ共鳴) で入射しました。高NA対物レンズを使用する場合、収集効率の向上は無視できます。したがって、強化された抽出と QY の係数は \(\scriptstyle{\Lambda }_{{{\rm {extraction}}},{\exp }}\cdot {\eta }_{{{\rm { QE}}}}=\frac{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {PC}}}}-{I}_{{{\rm {QD}} }}^{{{\rm {Glass}}}}{{I}_{{{\rm {QD}}}}^{{{\rm {Glass}}}}}\) バックグラウンド補正後。平均抽出強化係数 ~38.63 は、100 個の個別 QD のサンプルサイズに基づいて計算されており、前述のシミュレーションデータと同等です。

数値シミュレーションと同様に、時間分解フォトルミネッセンス (TRPL) 測定では、ガラスと比較した PC 表面上のアンサンブル QD の実験的なパーセル係数が約 3.11 であることが示されています。図3cに示すように、τglass = 5.32 ns (±0.24 ns)の平均減衰時間は、τpc = 1.71 ns (±0.31 ns)です。計算された発光率は、PC表面上のQDの横方向の位置に依存し、単一蛍光エミッターの広い波長範囲（500〜700 nm）で一定のままです（補足図S6を参照）。（補足パート9および図S5）で得られたスライドガラス上のQD-605の固有量子効率（QEi = 40.84％）を使用して、固有の非放射減衰率と放射減衰率の比を決定しました（\({\gamma }_{{{\rm {non}-{rad},i}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i}}}=0.4084\))。式を使用すると、 (3) および実験で分解された平均パーセル強調係数 \(({\gamma }_{{{\rm {rad},{PC}}}}/{\gamma }_{{{\rm {rad},i }}}=3.11)\)、\({{{{{\rm{QE}}}}}}}_{{{\rm {PC}}}}\) は 68.22% と推定できます。そして QE 強化係数 \(({{\eta }_{{{\rm {QE}}}}={{\rm {QE}}}}_{{{\rm {PC}}}}/{ {{\rm {QE}}}}_{{\rm {i}}})\) は 1.67 になります。

利用可能な光子状態の局所密度は、単独の QD と比較して、QD-PC 結合システムで増加します。これにより、励起状態 QD が寿命が短縮された (より速い減衰速度) で基底状態に遷移する放射減衰が加速され、光子が自発的に放出されます。この放射減衰プロセスのより高い速度は、オージェ再結合および/または表面トラップを通じて電子が失われ、オフ状態を引き起こす他の非放射減衰経路と有利に競合し、それによってまばたきが抑制されます。図 2h は、PCGR モードと組み合わせた QD の点滅抑制を示しています。閾値は平均バックグラウンドレベルの 2 倍として定義されます。オン時間の割合を計算すると、PC では 87.21%、ガラスでは 14.49% となります。しきい値を 2 つのオン状態とオフ状態の異なるピークの間の最小値として定義すると、同様の値が得られました。 PC（青）とガラス（黄）の両方のQDのオン期間とオフ期間の確率は、図3fに示す形式のべき乗則分布に適合しました。「オン」時間の電力パラメータ、αon = −1.63、ガラスケース上のQDの場合、「off」パラメータ、αoff = −0.95。 PC上のQD（図3e）の場合、オンおよびオフの確率パラメーターはαon = -0.98、αoff = -1.71であり、オンイベントの確率の増加とオフイベントの確率の減少を示しています。

PC 表面に固定化された単一 QD の高信号対雑音画像を収集できることを実証したので、次に、酵素フリー miRNA アッセイ用の生体分子タグとして QD を利用することを目指しました。その結果、PC 表面に 1 つの QD タグが取り付けられます。このタイプの検出をデジタル分解能と呼びます。これは、各 QD をカウントして、標的分子の酵素的増幅を必要としない直接的な定量的測定値を得ることができるためです。この場合、低濃度の標的分子は、低濃度で分布するタグを生成すると予想されます。検出面全体の密度。さらに、我々は、標的 miRNA 配列に対して高度に選択的であり、非標的配列の QD タグが捕捉されない分子生物学的アプローチを望んでいます。

ヒト血清中の miR-375 レベルと前立腺がんの転移、悪性度、および生存予後とを関連付ける最近の研究 57,58,59,60 に続き、このバイオマーカーを検出プラットフォームの機能を特徴付けるための最初のターゲットとして選択しました。図1aでは、PCは架橋活性化アッセイのバイオセンサー基板として利用されており、miRNA標的分子の反対側がQDおよびPC上に固定化された相補的な一本鎖核酸配列と結合します。したがって、QDがPCに強力な表面付着を形成するには、2つの高特異性核酸結合相互作用が発生する必要があり、miRNA標的分子はQDとPCの間の生体分子の架橋として機能します（図4a）。

a ブリッジ活性化アッセイプロセスでは、標的 miRNA が表面結合複合体の形成を架橋するときに、QD タグが PC 表面に引き下げられます。 b PC に接続された QD の数をカウントするラインスキャンプロセスの図。 c ラインスキャンイメージング: ヒト血清中の PCEF 強化デジタル計数用。標的濃度: 10 aM ～ 1 nM。 FOV: 300 μm × 300 μm。スケールバー: 40 μm。データは 9 つを超える FOV からの平均であり、エラーバーは 3 つの独立したレプリカ間の標準偏差を示します。統計的有意性は、ネガティブコントロールグループとすべてのテストグループの間で一元配置分散分析を使用して P < 0.0001 でテストされました。 PC でのアッセイのイメージング条件: レーザー出力 = 1 mW、EM ゲイン = 40 倍。 1 nM での信号飽和を回避しながら、ガラス上の 1 ～ 10 pM での強度変化を検出するには、より高いレーザー出力 (5 mW) と EM ゲイン (1200 倍) が必要です。同じ積分時間 (600 ms) と対物レンズ (×50、NA = 0.5) を両方の表面アッセイに適用しました。 d デジタル計数結果の 2 時間のインキュベーション後の 109 倍濃度範囲にわたるさまざまな濃度の用量反応曲線。エラーバーは、n = 3 の独立したアッセイの平均と標準偏差を表します。 e 単一塩基不一致識別テスト。ラインスキャン画像パネルは、ターゲット miR375 完全一致 (PM) グループの捕捉された QD のデジタル解像度と 3 つの異なる SNV のデジタル解像度を 100 pM で示します。 f 完全一致ターゲット配列と 100 pM 濃度での SNV ケースの定量化。統計的有意性は、独立した t 検定 (両側) を使用して検定されました。 ****P < 0.0001。エラーバーは、n = 3 の独立したアッセイの平均と標準偏差を表します。

PC は、最初に均一なエポキシシラン層を蒸着することによって準備されました。シラン処理の前に、PC の表面を酸素表面プラズマで 10 分間処理し、有機汚染を除去するだけでなく、-OH 基の密度を生成して表面を活性化しました。示されている miR 特異的 DNA プローブとターゲットオリゴは、NUPACK61 を使用して設計されました (補足パート 15 を参照)。プルダウンキャプチャ核酸プローブシーケンス (黄色) は、PC 表面機能化のためにシラン化層に共有結合するための 5' 末端に NH2- (アミノラジカルグループ) 修飾を備えた一本鎖 DNA (ssDNA) です。 ssDNA プローブ (青色) は、ビオチンとストレプトアビジンの相互作用を通じて QD タグ (68 nM) と結合し、繰り返しの濾過によって精製されます。さらに、QDタグ付きssDNAプローブを設計し、QDとPC表面間の立体効果を防ぐためにスペーサーとして5塩基オリゴ(T)リンカーを使用して配列を捕捉します。

miR-375 検出ターゲット (ピンク) には 22 の核酸塩基が含まれており、5' 末端 (10 塩基) は PC 表面 (黄色) の捕捉配列に相補的であり、3' 末端 (12 塩基) は QD に相補的です。 -ssDNA プローブ配列 (青)。この塩基対構造の相補的な性質により、標的 miRNA は、DNA-RNA 二重鎖を形成することでキャプチャーと QD-ssDNA プローブ間の接続を安定化する架け橋のように機能することができます。ブリッジ (ターゲット miRNA) がなければ、蛍光タグ (QD-ssDNA プローブ) は PC 表面に引き下げられないため、たとえ励起レーザーで照射されたとしても、前述の 3000 倍の増強は受けられません (図 2)。 4b）。特異的かつ堅牢なハイブリダイゼーションプローブ設計に関する最近のガイドラインに従って、DNA プローブとターゲット間の反応ギブスエネルギーがほぼゼロ (ΔG' ~ 0)62 になるように最適化しました。 ΔG' ~ 0 では、単一ミスマッチの平均エネルギーペナルティは完全マッチの自由エネルギー利得よりも大きく (ΔΔG)、それによって最適に近い特異性でオフターゲット結合を制限し、99.2% のハイブリダイゼーション収率を提供します ( 23 °C、Na+: 1 mM)。 NUPACK は、核酸の二次構造と自由エネルギーの観点から平衡塩基対合特性をシミュレートするために使用されました。キャプチャープローブと ssDNA プローブの両方の核酸の数は、望ましくない二次構造の形成を最小限に抑えるために慎重に選択されました。たとえば、キャプチャー配列の塩基数が 10 から 12 に増加すると、キャプチャーオリゴはヘアピンループ構造を形成し、ターゲット miRNA の下部と対形成する能力を失います。

PC はエバネッセント場強化と強化された誘導抽出を通じて表面に近接した QD タグ付きプローブのみを強化するため、PCGR 強化顕微鏡では TIRF のような Z セクションが提供され、表面から約 60 nm 以内の QD タグのみをカウントできるようになります。。その結果、プルダウンされた QD のみが強化され、個々の結合イベントに対して陽性シグナルが報告されます。一方、強化されていない単一の QD はバックグラウンドノイズに匹敵するため、結合されていない自由 QD はカウントされません。さらに、PC 表面と QD 表面は両方とも陰イオン性であり、ssDNA 配列によって結合されており、PC 表面への QD の非特異的接着を防ぐために互いに静電気的に反発する傾向があります。前述の 2 ステップアッセイは、規定濃度の miR-375 を連続的にインキュベートし (4 時間)、続いて一定量の ssDNA-QD プローブを PC 接着ポリジメチルシロキサンウェルに添加 (2 時間) (ウェルあたり約 45 μL) することによって実行されました。）。各インキュベーションステップには、遊離ターゲットと結合していない QD タグを除去するための穏やかな洗浄ステップが伴います。

従来の表面捕捉アッセイでは、1,000倍の濃度範囲にわたってサブナノモルレベルで蛍光標識された分析物を測定できますが、多くの生体分子はサブフェムトモルレベルに至るまで、豊富に1,000,000倍を超える変動を示します。デジタル PCR 増幅ベースのアッセイでは、正確な熱サイクル制御を使用して、最大 5 桁まで改善されたダイナミックレンジで核酸の絶対定量を行うことができます63、64、65。酵素増幅を使用しない場合、我々の以前の研究66では、単一分子計数と強度キャリブレーションを組み合わせて、蛍光アッセイのダイナミックレンジを同様の範囲（105倍）に拡大し、NA = 1.46のTIRF顕微鏡を使用して〜10 fMの検出限界に達することができることを示しました。、×100 レンズと高利得 EMCCD。最終的に、PC-QD アッセイによるマルチエンハンスメントにより、安価な光学系 (NA = 0.5 の対物レンズ、低出力レーザーダイオード、および低 EM ゲイン CCD) で単一 miRNA を直接計数する酵素フリーのデジタル分解能バイオセンシングが提供できることを実証します。直接計数機能により、10 aM ～ 1 nM の標的濃度範囲にわたって対数対数スケールでプロットすると線形の用量反応特性が得られ、アナログアンサンブル強度測定と比較して検出限界が 10,000 倍向上します。

循環 miRNA はヒト血清中で非常に安定しており 67、血清中の miR-375 の直接検出が可能であることが最近示されました 68。未処理のネイティブサンプルマトリックスにおける QD ベースのデジタルセンシングの実現可能性を実証するために、ヒト血清 (Sigma-Aldrich、H3667) に 100 zM から 10 nM までの 12 種類の最終濃度で miR-375 ターゲットをスパイクし、 RNAの抽出や精製を行わずにセンシングアッセイを行うことができます。図4c、dは、ガラス表面ベースのアッセイ（SI、図S14）からの従来のアナログ強度測定と比較した、PC強化デジタル解像度計数結果を示しています。ラインスキャンの結果は、緩衝溶液中の特定の濃度の標的 miRNA についての前述のアッセイの選択された表示です。ライン走査型顕微鏡は、QD タグの計数または平均強度の記録のために、視野 (FOV) 内の各ピクセルから QD 発光を取得するようにプログラムされました。各テストウェルについて、FOV = 1 mm × 1 mm で表面全体をスキャンし、それを 9 ～ 11 の小さな領域 (サブ FOV = 300 µm × 300 µm) に分割しました。代表的な値を取得するために、各グループの報告されるカウントは、9 ～ 11 個のサブ FOV すべての平均です。 Bradley 局所しきい値処理 69、適応コントラスト強調 70、サイズ依存の粒子識別など、いくつかの画像解析アルゴリズムが採用されています。図 4d は、試験サンプルを PC (結合平衡状態) と 2 時間インキュベートした後の捕捉 QD 数を、段階希釈した miR 濃度の関数として示しています。10 aM および 1 nM が最低濃度 (miR なしを除く) と最高濃度を表します。それぞれ測定しました。図4dに示すエラーバーは、個々の液体コンパートメント内の3つの生物学的複製から得られた標準偏差を表します。選択を避け、他の人為的要因を最小限に抑えるために、標的濃度の標識、アッセイインキュベーション、および粒子計数中に 3 つの独立した二重盲検実験が実行されました。予想どおり、イメージング時間全体にわたって、0 M miRNA-375 (図 4c の参照グループ) では無視できる量の QD バックグラウンド結合が観察されました。 0 μM での標準偏差の 3 倍間の有意な計数差により、10μM の検出限界 (LOD) が実証されます。ターゲット濃度をさらに下げると（1 aM および 100 zM）、表面捕捉ターゲットの利用可能性がサンプル量によって制限されるため、バックグラウンド信号と同じレベルでの計数結果が得られます（SI パート 15 を参照）。 PC 支援の単一ターゲット計数を使用しない場合、従来のアナログ強度測定では、LOD 1 ～ 10 pM に達するには、より高いレーザー入射パワー (5 mW) と CCD カメラからの最高の EM ゲイン設定 (1200 倍) が必要です (SI 図.S16)。

アッセイの選択性を実証するために、NUPACK を使用して、miR-375 ターゲットに沿った 22 位置すべての単一塩基ミスマッチバリエーション (単一ヌクレオチドバリアント、SNV) をシミュレートしました。結果（SI、図S17）は、我々のブリッジアッセイが、この特定の変異が存在する位置インデックス4〜8（5'末端から数えて）の単一塩基変異に対して選択的であることを示しており、臨床的重要性があることが報告されています71。図 4e、f は、インデックス #4、#6、および #8 の SNV に起因する粒子計数の劇的な減少を示しており、信号減少の範囲は 90 ～ 92% です (計数結果の差: \(\triangle N=\) frac{{N}_{{{\rm {PM}}}}-{N}_{{{\rm {MM}}}}}{{N}_{{{\rm {PM}}}} }\) = 90 ～ 92%、2 時間の完全一致グループ (PM) と比較した両側 P 値 <0.0001)。

ブリッジ接続反応が平衡に達したときの終点値を調べることに加えて、プロセス中に PC 表面をサンプリングしている QD の運動軌跡の動的特性を分析することにより、QD と PC 表面の間の過渡的な相互作用も比較しました。バインディングの。システム全体の自由エネルギーを増加させ、相互作用の持続時間を延長するために、QD あたりの ssDNA プローブの比率を 10:1 から 5:1 に減らしました。 ssDNA 官能化 QD プローブを添加した直後に、蛍光画像シーケンスの記録を開始します。何もない表面から始めて、テストサンプルと約10分間インキュベートした後、イメージング視野でQD発光を観察しました。単一粒子追跡アルゴリズムは MATLAB u-track ソフトウェア 72 を使用して実装され、各粒子の軌道が拡散について分析されました。 SI図S15に示すように、表面結合QDの明確な軌跡を観察し、結合識別によって引き起こされるそれらの固有の指紋を実証するために2つの代表的な画像を選択しました。我々は、ブリッジアッセイで miRNA と ssDNA の相互作用の解離定数を操作すると、表面局在拡散経路にばらつきが生じるのではないかと仮説を立てています。単一ナノ粒子追跡の標準的な方法に従って、時間依存の平均二乗変位 (MSD) を計算することにより、軌道をさらに分析しました。結果として得られる軌道は、通常、その運動挙動のタイプについて分析されます。これは、その運動が粒子 (QD プローブ) とその周囲 (さまざまなターゲット基板) の間の相互作用に関する情報を提供するためです。 SI 図 S15 の 5 つの線形 MSD プロット (緑) は、ターゲット基板に 1 塩基の不一致がある場合の正常な拡散を示し、r2 ∝ Dτ (r2: 拡散変位、D: 拡散係数、τ: 時間間隔) で説明できます。）。逆に、完全一致グループ (青) の MSD は、τ が大きくなるほど最大値に漸近し、QD プローブが r2 ∝ 1-e-Dτ の関係で閉じ込められた拡散または囲い込まれた拡散を受けていることを示しています。

近接場 QD 励起と遠方場分散誘導アウトカップリングの両方で PC 強化を利用することにより、最大 3000 倍の QD 発光の増幅を提供するシンプルなフォトニックバイオセンサープラットフォームを開発しました。 0.5 という低い開口数でも単一の QD を分離することができ、安価な光学セットアップで個々の標的分子のデジタル分解能を提供し、高度に特異的で広範囲の動的、迅速かつ臨床的に適切なアトモル miRNA 検出が可能になりました。当社の PC-QD イメージングプラットフォームは、EMCCD カメラの高ゲイン (×40、カメラの最大 EM ゲインのわずか 1/30) を必要とせず、装置のコストと複雑さをさらに削減します。

ブリッジアッセイは、酵素による標的増幅を行わずに室温で実施され、qRT-PCR と比較してシンプルなワークフローを表します。 QD タグの質量が小さいため、重力による沈殿が減少し、(非特異的結合または吸着による) バックグラウンド数が低くなります 73。ターゲット捕捉のプレインキュベーションにより、各表面に付着した QD に単一のターゲット分子のみが確実に含まれるようになり、広範な分析対象物濃度 (0.01 fM ～ 1 nM) に相関する線形の用量反応曲線が得られ、定量化が容易になります。ポアソン統計分析による検出後の補正の必要性74。データを対数対数スケールでプロットすると、線形の用量反応プロットが観察されます（図4b）。観察された挙動は、(a) 特に低濃度で捕捉できるバイオセンサー表面への miRNA の限られた拡散 75、および (b) 立体障害と表面飽和、つまり分画が含まれるいくつかの要因の結果です。高濃度では PC 表面上の利用可能な結合部位が減少し、新たに到着した miRNA が結合することがより困難になります 76, 77。重要なことに、用量反応プロット (図 4b) は、隣接する濃度に基づく有意な重複を示していないことに注意してください。各濃度での 3 つの独立した測定値の標準偏差値に基づいて計算します。したがって、我々の研究で示されたデジタル解像度検出アプローチは、ddPCR や Quanterix Simoa™ などのアプローチで必要なポアソン補正を必要としません。この場合、複数の標的分子が同じナノ液滴体積内に閉じ込められ、一緒に増幅されながらも 1 つの陽性イベントのみが得られます。。

一塩基変異体 (SNV) は、2 時間後の静的計数で空間的に検出されるシグナルが大幅に減少するため、識別できます。さらなるステップとして、単一QDの動的軌道解析を使用してDNAハイブリダイゼーションの反応速度と一時的な相互作用を調査し、洗浄せずに10分間でSNVを識別できることを実証しました。これは、個々のタグが特異的に結合しているかどうかを区別するためのさらなるルートを提供する可能性がありますまたは非特定的に。興味深いことに、強化効果を組み合わせると、室温でのPCオン共鳴条件下で入力レーザーパワーが3 mWを超えると、QDの飽和と多励起子の生成を観察できます（補足図S7）。

当社の PC 強化 QD 発光プラットフォームは、厳密には単一波長に限定されません。 PC によってサポートされるさまざまなリーキーモードのスペクトルの重複および分散特性を設計することにより、同じ励起波長を利用する広範囲の蛍光種 (QD-525、QD-565、QD など) に増強効果を拡張できます。 -585、QD-625、QD655、QD685）。このレポートの焦点ではありませんが、ここで説明するアプローチは、将来的に異なる発光スペクトルを持つ QD タグを使用することで簡単に多重化でき、各 QD の色が同じテストサンプル内の異なる miRNA ターゲット配列のアッセイを表すことができると予想されます。。今後の研究では、複数の標的 miRNA 配列を、別々に共固定化されたキャプチャ DNA 配列と組み合わせて、単一のテスト領域内での多重化を可能にする予定です。

PC の製造は、続いて直径 200 mm のガラス基板 (Corning、0.7 mm Eagle XG ディスプレイグレードガラス) 上に厚さ 10 nm の Al2O3 エッチングストップ層と 130 nm の SiO2 薄膜を堆積することから始まりました。次に、サブ波長格子構造を大面積深紫外（DUV）リソグラフィーによってパターン化し、続いて鋳造工場（Moxtek, Inc. Orem, UT）によってドライエッチングを実行しました。次に、ウェーハを小さなチップ (1.2 cm × 2.5 cm) に切り分けました。高屈折率の Si3N4 フィルム (約 115 nm) と薄い TiO2 生体適合性コーティング (約 5 nm) が、スパッター (Kurt J. Lesker PVD 75) を使用してパターン化された基板上に堆積されました (特性評価の詳細については補足を参照)。

自作のライン集束顕微鏡（補足図3）を使用して、PC-QDシステムを励起し、QDの蛍光強度、発光スペクトル、miRNAアッセイのスキャン結果を調べました。 450 nm レーザーダイオード (OSRAM、PL450B) が励起光源として機能します。蛍光シグナルは、電子増倍電荷結合素子 (EM-CCD) カメラ (浜松市、C9100-13) を備えたイメージング分光計 (Horiba iHR 550) によって画像化されます。 PC 上のすべてのアッセイスキャン画像と励起増強係数テストは、低 NA ×50 レンズと低レーザー出力 (オリンパス LMPLFLN ×50、NA = 0.5、レーザー出力 = 1 mW) を使用して実行されます。単一 QD は低 NA レンズを使用したガラス上では解像できないため、高 NA ×100 レンズとより高いレーザー出力 (Zeiss alpha Plan-APO ×100 Oicl DIC、NA = 1.46; レーザー出力 = 2.1 mW)。実験的な後焦点面画像は、Bertrand レンズ (焦点距離 180 mm) と ×100 オリンパス対物レンズ (LMPLFLN ×100、NA = 0.8) を使用して撮影されました。

推定された強化効果を計算するための品質係数を実証するために、ベア PC の角度分解遠視野特性評価が実行されました。サンプルは水で覆われ、y 軸が回転軸と一致するように電動ローターに取り付けられました。重水素ハロゲンランプからの白色光の平行ビーム (面積 ~ 5 mm2) が直線偏光子 (TE 偏光) を通過し、入射角 θ でサンプルに入射します。一連の入射角での 0 次反射光は、光ファイバーを使用して収集され、分光計 (Ocean Optics 20000) に送られました。 PC-QD システムの出力結合発光スペクトルは、CCD カメラ (Princeton Instruments、PIXIS) を備えた分光計 (Acton Research、SpectraPro 500i) のスリット上にレンズによって集束された角度 θcol = 26° で収集されました。

時間分解フォトルミネッセンス（TRPL）は、カスタムビルドのセットアップを使用してアンサンブルQDから測定されました（補足図S4）。励起源は光学パラメトリック発振器を備えた Ti:sapphire レーザー (Spectra-Physics Mai Tai) で、λlaser = 425 nm、繰り返し率 80 MHz で 100 ～ 120 fs パルスを生成しました。励起は、電力 2.1 mW の PC ポンプモード (θin = 26°) からのオフレゾナンスでした。発光は QD 出力結合角 (θcol = 26°) で収集され、550 nm のロングパスフィルターを通過して励起レーザーを除去し、シリコン単一光子アバランシェフォトダイオード (Si-SP-APD) 上に画像化されました。 APDは、単一光子パラメータタグモードと光子分布モードを組み立てて光子到着時間のヒストグラムを生成する、時間相関単一光子計数モジュールに接続されました。システムの時間分解能は約 22 ps でした。

すべての測定は、PC への平均入射電力 1 ～ 2.1 mW で実行されました。励起電力の関数としての発光強度の依存性に基づいて、すべてのサンプルの測定は線形（不飽和）領域で実行されたと結論付けます（補足図S7）。

量子ドットの透過型電子顕微鏡 (TEM) 画像は、200 kV で動作する JEOL 2100 Cryo TEM を使用して収集されました。 PC-QD サンプルの走査型電子顕微鏡 (SEM) 画像は、Hitachi S-4800 電界放出型 SEM を使用して取得されました。 SEM の前に、薄い導電層 (鳥瞰図では金パラジウム、断面図ではカーボン) をサンプル上にスパッタリングしました。

PC の断面高さプロファイルは、厚さ 30 nm のアルミニウム反射コーティング (Budget Sensors) を備えたモノリシックシリコンチップを使用した接触モードの原子間力顕微鏡 (AFM) (Cypher、Asylum Research) で分析されました。

PC チップをアセトン (Sigma-Aldrich)、イソプロピルアルコール (Sigma-Aldrich)、および脱イオン水中でそれぞれ 2 分間超音波処理し、圧縮窒素流下で乾燥させた後、500 mTorr の圧力で 200 W の酸素プラズマ処理を行いました。 Pico Plasma System (Diener electric、ドイツ) を使用して 10 分間。ガラス反応チャンバー内で、(3-グリシドキシプロピル) トリメトキシシラン (GLYMO、Gelest、モリスビル、ペンシルベニア州、米国) を、真空オーブン内で 80 °C、30 Torr の条件で 4 ～ 5 時間 PC 表面に蒸着しました。。蒸着中の各 PC チップについて、100 μL の GLYMO をガラス反応チャンバーに加えました。堆積したＰＣチップをオーブンから取り出し、トルエン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、メタノール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、および脱イオン水中でそれぞれ２分間超音波処理し、窒素乾燥した。 1.25 cm2 PC 表面の DNA 機能化の場合、容量 40 μL、50 μM アミノ末端 PC キャプチャオリゴ (1×TE バッファー、0.05% TWEEN-20、pH = 9.0) を GLYMO 堆積 PC 上に分注します。表面。室温で6時間インキュベートした後、TE緩衝液濃度を1×から0.01×まで徐々に減少させてPCチップを洗浄した。ブロッキングバッファー（SuperBlock TBS、Thermo Fisher Scientific）を20分間添加し、使用前に1×TEバッファーを使用して2回洗浄しました。

ストレプトアビジン (SA) でコーティングされた QD605 (Invitrogen) を、5000 × g で 3 分間遠心分離した後、上清から分離しました。 ssDNA プローブとストレプトアビジン (SA) でコーティングされた QD605 (Invitrogen) を 1 × TE バッファー中で化学量論比 10:1 (プローブ:QD) で結合させ、十分な量を確保するために回転装置で穏やかに混合しながら室温で 2 時間インキュベートします。反応。次いで、０．５ｍＬのアミコンフィルター（ＭＷＣＯ５０ｋＤａ）を使用して複合体を濾過し、溶液から遊離のＤＮＡプローブを除去した。 QD の最終濃度は約 68 nM です。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究の結果を裏付けるデータは、論文およびその補足情報内で入手できるか、または要求に応じて対応著者から入手できます。

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この研究は、国立衛生研究所 (NIH) R01-GM108584 (BTC)、R01-CA227699 (AMS、BTC、および MK)、R01-CA212097 (MK)、国立科学財団 (NSF) CBET-1900277 (BTC) によってサポートされています。）、カール・ウォーズ研究所のゲノム生物学博士研究員フェローシップ（TCおよびLZ）、イリノイがんセンターのC*STAR研究フェローシップ（YX）およびTiMEフェローシップ（OHA）。著者らは、GA Fried、G. Popescu、JANT Soares、PR Selvin、S. Sarkar、OR Teniola、DE Vaz、LE Kwon、J. Tibbs、S. Shepherd、BK Maity、AJ Cyphersmith、E. Araud、C. に感謝の意を表します。 -W. Kuo、Y. Zhuo、P. Le、F.-C. Hsiao 氏、LD Akin 氏、S. Nalla 氏、N. Chauhan 氏、A. Igarashi 氏、およびナノセンサーグループの残りのメンバーに貴重な議論をしていただきました。著者らは、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校材料研究所の H. Zhou、JC Spear、KA Walsh、W. Swiech、KM Flatt のトレーニングとサポートに感謝し、W. Wang のカバースリップ洗浄の支援に感謝します。著者らはまた、回折格子構造の SEM 画像を提供してくれた MOXTEK, Inc. と Y. Yan に感謝します。

イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校電気・コンピュータ工学部、アーバナ、イリノイ州、61801、米国

ヤンユー・ション、チンラン・ファン、プリヤシュ・バリヤ、シェンヤン・リウ、ケイトリン・M・レース、ブライアン・T・カニンガム

ホロニャックマイクロおよびナノテクノロジー研究所、イリノイ大学アーバナシャンペーン校、アーバナ、イリノイ州、61801、米国

Yanyu Xiong、Qinglan Huang、Taylor D. Canady、Priyash Barya、Shengyan Liu、Caitlin M. Race、Congnyu Che、Xiaojing Wang、周立峰、Xing Wang、アンドリュー M. スミス & ブライアン T. カニンガム

Carl R. Woese Institute for Genomic Biology、イリノイ大学アーバナ・シャンペーン校、アーバナ、イリノイ州、61801、米国

テイラー・D・カナディ、シャオジン・ワン、周立峰、シン・ワン、ブライアン・T・カニンガム

イリノイ大学アーバナシャンペーン校生物工学部、アーバナ、イリノイ州、61801、米国

オパイエミ・H・アログンデ、コンニュ・チェ、シン・ワン、アンドリュー・M・スミス、ブライアン・T・カニンガム

ハンツマンがん研究所腫瘍科、ソルトレイクシティ、ユタ州、84112、米国

マニッシュ・コーリ

カール・イリノイ医科大学、イリノイ州アーバナ、61801、米国

アンドリュー・M・スミス

イリノイ大学アーバナシャンペーン校材料科学工学部、アーバナ、イリノイ州、61801、米国

アンドリュー・M・スミス

イリノイがんセンター、イリノイ州アーバナ、61801、米国

アンドリュー・M・スミス＆ブライアン・T・カニンガム

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YX と BTC がすべての実験を考案し、設計しました。 YX はすべての光学実験、バイオアッセイ実験を実行し、QH、CMR、Xing W. の支援を受けて PCEF 光学セットアップを構築し、LZYX、QH、AMS、LZSL Xiaojing W.、および TDC がデータを解釈しました。 CMR は PC 構造とラインスキャンソフトウェアを設計しました。 YX と TDC はブリッジアッセイを設計しました。 YX、PB、SL、QH がシミュレーションを実行しました。 SL、YX、および PB は強化係数を計算しました。 OHA はゲル電気泳動を実行しました。 CC は拡散シミュレーションを実行しました。 YX は、SEM、TEM、AFM、および光学特性評価を実行しました。 LZ と Xing W. は、ヒト血清のバイオアッセイ用の実験材料を提供しました。 BTC、AMS、MK、および Xing W. が研究を監督しました。 MK は miRNA ターゲットバイオマーカーを特定しました。 YX は、すべての著者からの意見を取り入れて原稿を書きました。

ブライアン・T・カニンガムへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Communications は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。査読者レポートが利用可能です。

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転載と許可

Xiong, Y.、Huang, Q.、Canady, TD 他フォトニック結晶は、単一量子ドットのデジタル解像度バイオセンシングのための蛍光発光と点滅抑制を強化しました。 Nat Commun 13、4647 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

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受信日: 2021 年 6 月 21 日

受理日: 2022 年 7 月 29 日

公開日: 2022 年 8 月 8 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32387-w

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