インターフェロン | 雲南ガラス製品グループ

細胞死と病気 14 巻、記事番号: 319 (2023) この記事を引用

320 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

NOS2 および COX2 腫瘍発現と ER 乳がんにおける不良な臨床転帰との間に強い相関関係が確立されています。しかし、これらの酵素による腫瘍誘発のメカニズムは不明です。 The Cancer Genome Atlas (TCGA) の分析により、NOS2 および COX2 の発現と Th1 サイトカインの間の相関関係が明らかになりました。ここで、TNBC細胞の単一細胞RNAseq分析は、IL1βまたはTNFαと組み合わせたIFNγによる強力なNOS2およびCOX2誘導を示しています。 IFNγ が細胞溶解性リンパ球によって分泌され、臨床転帰を改善することを考えると、IFNγ のこの役割には二分法が存在します。この難題を調査するために、進行性の ER-、TNBC、および HER2 + 乳房腫瘍における腫瘍 NOS2、COX2、および CD8+ T 細胞を空間的に分析しました。 NOS2 発現腫瘍細胞の高発現とクラスター化は、間質制限 CD8+ T 細胞の存在下で腫瘍/間質界面で発生しました。 COX2 発現腫瘍細胞の高発現とクラスター化は、CD8+ T 細胞の浸透が制限されているか存在しない腫瘍中心部の免疫砂漠領域にまで広がりました。さらに、NOS2 を高発現する腫瘍細胞は衛星増殖が増加した領域の近位にあり、転移能がより高い細胞クラスターを示唆しています。さらにインビトロ実験で、IFNγ + IL1β/TNFα が治療腫瘍細胞の伸長と移動を増加させることが明らかになりました。腫瘍微小環境のこの空間分析は、転移の可能性を高める可能性がある、間質限定性 CD8+ T 細胞が NOS2 発現腫瘍ニッチの近位に存在する明確な近傍についての重要な洞察を提供します。

エストロゲン受容体アルファネガティブ (ER-) およびトリプルネガティブ乳がん (TNBC) は、乳がんの種類の中で占める割合は小さいですが、悪性度の低い ER + 腫瘍と比較すると、最も悪性度の高い悪性腫瘍の 1 つであり、治療戦略も限られています [1]。過去 10 年間に、かなりの割合のがんで NOS2 発現の上昇が示され [2]、黒色腫から神経膠腫に至るまでのがんが NOS2 を過剰発現しています [3、4、5、6]。乳がんでは、患者の 70% 以上で NOS2 の増加が報告されています [7]。興味深いことに、腫瘍 NOS2 発現の上昇は P53 変異と相関しており、ER − (ハザード比 = 6) では生存率の低下を予測しましたが、ER ＋乳がん患者では予測できませんでした [7、8]。同じコホートの ER 患者における HR 2.45 によって定義されるように、腫瘍 COX2 発現の上昇も予後不良を予測するものでしたが [9]、NOS2/COX2 共発現の上昇は予後不良を強く予測しました (HR 21) [10]。これらの結果は、腫瘍の NOS2/COX2 共発現の上昇が悪性度の高い乳がん表現型の進行を促進することを示唆しています [10、11]。しかし、腫瘍内での NOS2/COX2 誘導のメカニズムは依然として不明です。

The Cancer Genome Atlas (TCGA) の検査により、腫瘍 NOS2/COX2 発現と、頻繁に関連するインターフェロンガンマ (IFNγ)、インターロイキン 17 (IL17)、IL1、およびトール様受容体 4 (TLR4) との相関関係が明らかになりました。抗がん作用を伴う[12]。興味深いことに、腫瘍の NOS2/COX2 発現の上昇は臨床転帰の不良を予測するため、これらの関連性は矛盾しています [7、9、10]。最近、IFNγ およびサイトカインまたは TLR4 アゴニストによる治療により、異なる免疫細胞および腫瘍細胞で NOS2 および COX2 発現の上昇が発見されました。これは、以前に報告されたフィードフォワード NOS2/COX2 シグナル伝達と一致しています [10、13]。これらの結果は、腫瘍の NOS2/COX2 発現間の直交関係を示唆しており、これが不良な臨床転帰の一因となる異なる腫瘍微小環境を促進する可能性がある [13]。

これらの可能性を探るため、本明細書では、Th1サイトカインがin vitroで腫瘍細胞におけるNOS2およびCOX2の発現を効果的に刺激することを示す。単一細胞 RNAseq (scRNAseq) 解析により、インターロイキン 1β (IL1β) または腫瘍壊死因子アルファ (TNFα) と組み合わせた IFNγ が、単剤としてのサイトカインよりも高い NOS2/COX2 発現を誘導することが明らかになりました。さらに、IL6 および IL8 を含む、NOS2 高発現 ER 乳房腫瘍で上方制御されたサイトカイン [7、10] は、これらの治療によって誘導され、NOS2/COX2 発現と相関していました。また、この研究は、NOS2 と COX2 の発現を増強する IL1α/β 間の独特の相乗効果を明らかにしました。マルチプレックス空間イメージングにより、IFNγを産生することが知られている間質限定CD8+ T細胞の領域に近位にNOS2を高発現する細胞のクラスターが明らかになり、これらの腫瘍の腫瘍/間質界面に小さな炎症ニッチがあることが示唆されました。 COX2 はこれらの領域に存在していましたが、腫瘍のさらに奥深く、CD8+ T 細胞の浸透が低い免疫砂漠領域ではより高度に発現していました。同じ腫瘍内の異なる部位、または腫瘍間の地理的領域を比較すると、限定されたリンパ球領域の炎症部位が空間的および時間的に進行し、COX2 発現が高い領域の免疫砂漠に進行することが示唆されます。これらの新しい観察は、疾患特異的な乳がん生存率の低下と相関する悪性度の高い腫瘍表現型の明確な空間的フィンガープリントを提供します [7、10]。

NOS2 および COX2 (PTGS2 としても知られる) 腫瘍発現の高低を比較した以前の研究では、通常抗腫瘍活性に関連するさまざまな炎症マーカーとの関連が明らかになりました [10]。これにより、NOS2/COX2 発現に対するサイトカイン調節効果を調査することになりました。腫瘍細胞および組織内。 ER 乳がんにおける NOS2 および COX2 の発現に関連する状態をより深く理解するために、Xena ブラウザーと TCGA データベースを使用して相関分析を実行しました。 TCGA-BRCA（乳がん）の相関分析により、抗腫瘍関連のIFNγ、TNFα、IL2、IL1を含む、臨床転帰に影響を与える腫瘍NOS2/COX2発現の増加に関連するいくつかの炎症経路（図1A）が明らかになりました（図1B）。、IL17 経路 (図 1A)。さらに、腫瘍のNOS2/COX2発現には正の相関があり、Th1サイトカインはCOX2と最も強い正の関連を示したのに対し、IL1βはNOS2と関連していた（図1A）。これらの所見は、腫瘍微小環境（TME）内の二分法を示唆しており、一般に良好な転帰と関連するサイトカインも腫瘍NOS2/COX2発現の上昇を促進し（図1A）、これらはER乳房における疾患特異的生存率の低下の強力な予測因子である。がん患者 (図 1B) [7、9、10]。 NOS2 および/または COX2 発現の誘導におけるこれらのサイトカインの調節的役割を確認するために、MDA-MB231 (MB231) 乳がん細胞を、TNFα、IL1β、IL17、および TLR4 の存在下および非存在下で IFNγ で刺激しました。アゴニストリポ多糖（LPS）。単一細胞 RNAseq データは、TNFα または IL1β と組み合わせた IFNγ への 48 時間の曝露が、NOS2 および COX2 の最も高い発現を誘導することを明らかにしました (図 1C)。マウス腫瘍に関する以前の報告[12]と一致して、NOS2 の高発現には IFNγ と TNFα/IL1 が必要であり、これらはマウスのマクロファージと腫瘍細胞の誘導中に生成されるサイトカインに顕著な違いを示します [12]。さらに、サイトカイン刺激されたMB231細胞のscRNAseqにより、IL1βまたはTNFαの存在下でIFNγで48時間刺激すると、最も高いNOS2およびCOX2発現が誘導され、それらはt-SNEプロットの同じ領域に集中していることが明らかになりました（図1C、D））。これらの結果は、TCGA 分析で示されるように、高い NOS2 および COX2 発現が IL1β または TNFα と組み合わせた IFNγ によって誘導されることを裏付けています。予想どおり、IFNγ + IL1β/TNFα の scRNAseq 分析により、処理した MB231 細胞における NOS2 および COX2 の転写レベルの増加が明らかになりました。 NOS2 転写物の数は 1 ～ 3 の範囲でしたが、COX2 転写物の数はかなり広い範囲でした (図 1D)。 NOS2 転写物を含む細胞は 9% 未満でしたが、最大 40% の細胞に COX2 転写物が含まれていました (図 1D)。 NOS2の発現にはIFNγが必要でしたが、COX2の発現はIL1βまたはTNFα単独によって弱く誘導されました（図1D）。それにもかかわらず、NOS2 と同様に、最も強い COX2 発現は IFNγ + IL1β/TNFα によって起こりました。以前に報告されているように、サイトカイン刺激に加えて、NOS2/COX2 フィードフォワードシグナル伝達も NOS2/COX2 発現の上昇を促進する可能性があります (図 1A)。

UCSC Xena ブラウザを介して Th1、Th2、Th17、および 2 つの GOI (目的の遺伝子) 遺伝子を分析する、TCGA-BRCA (n = 1248) データベースのピアソン相関分析の AA ヒートマップ表示。ヒートマップは R (4.2.1) の corrplot (0.92) で生成されました。 B NOS2lo/COX2hi (青色の矢印)、NOS2lo/COX2lo (緑色の矢印)、NOS2hi/COX2lo (黄色の矢印)、および NOS2hi/COX2hi (赤色の矢印) 腫瘍タンパク質発現に関連する生存分析。 C t-SNE プロット (Loupe Browser 6.3.0) 、IL17 (100 ng/ml)、および LPS (10 ng/ml) を 24 時間および 48 時間培養しました。明るい緑色のクラスターと濃い緑色のクラスターは、それぞれ、IFNγ + IL1β/TNFα 治療に関連する 24 時間および 48 時間の時点を表します。オレンジ色の円は、48 時間の処理後の IFNγ + IL1β または TNFα の最も重複した細胞クラスター化を示します。 Dは、NOS2およびCOX2クラスタリングセルのt-SNEプロット。積み上げ棒グラフは、48 時間処理グループにおける細胞あたりの NOS2 および COX2 転写物の数を示します。セルごとの転写データ (カラーコード: 青、1、オレンジ、2、グレー、3、黄、4、シアン、5、緑、6) は、R パッケージ (data.table 1.14.2、dplyr 1.0.10) を使用して抽出されました。、ggplot2 3.3.6)。

がん幹細胞性マーカーは、非常に低濃度でマウスに注射した場合、CD44 発現レベルが上昇し、CD24 発現レベルが低下した細胞集団において、由来する腫瘍と同じ薬剤耐性の組織病理学的特徴を示すことが報告されている[14]。ここで、CD44 / CD24発現のt-SNEプロット分析により、IFNγ + IL1βまたはTNFαで48時間処理した後のNOS2 / COX2高発現クラスターにおけるCD44レベルの増加とCD24レベルの減少によって定義される明確なクラスターパターン（図2A）が明らかになりました。このパターンは癌の幹細胞性の増加を示唆しており[14]、NOS2を高発現するER乳癌におけるCD44レベルの上昇に関する以前の報告と一致している[7、15]。線維症マーカー [16] である組織阻害剤メタロプロテイナーゼ 1 (TIMP1) の発現は CD44 と類似しており、それらの発現が同じ上流制御因子によって制御されている可能性が高いことを示しています (図 2A)。 Th1 サイトカイン間の発現関係を調べるために、IL6、IL8、IL1α、および IL1β のクラスタリングパターンを分析しました (図 2B)。これらのサイトカインのクラスター化パターンは非常に類似しており、IFNγ + IL1β/TNFα による 48 時間の刺激後に強く重複します (図 2B)。さらに、他のサイトカイン誘導性遺伝子の検査により、IL1α/βとの強い関連性が明らかになり(図2C)、これは循環IL1βが生存率の低下を予測することを示す観察結果と一致している[17]。まとめると、これらの発見は、図 1A に示す TCGA-BRCA 相関分析を裏付けます。

A はがん幹細胞 (CD24/CD44) および線維症 (TIMP1) マーカー、B Th1 サイトカイン (IL6、IL8、IL1β、IL1α) マーカーの t-SNE プロット。パネル A に示す NOS2/COX2 と同じ領域にクラスター化されています。 C 選択したサイトカイン、癌幹細胞マーカー、転移関連遺伝子の相関分析。データは、R (4.2.1) の corrplot (0.92) で 48 時間の対照、IFNγ、IL1β、および IFNγ + IL1β 処理群から抽出されました。 NOS2 は、対照細胞および IL1β 処理細胞では発現されなかったため、相関分析には表示されません。

上記の in vitro 所見は、IFNγ が ER 乳房腫瘍細胞における NOS2/COX2 発現の誘導における重要な調節因子であることを示しており、腫瘍組織における IFNγ 分泌の起源に疑問が生じています。細胞傷害性リンパ球は IFNγ を放出し、TNBC および他の種類の癌における生存率の向上と関連しています [18、19、20]。対照的に、腫瘍の NOS2/COX2 発現の上昇は疾患の進行を促進し、疾患特異的な乳がんの生存率低下を強く予測します [7、9、10]。これらの所見は、抗腫瘍リンパ球産生 IFNγ 細胞が前腫瘍 NOS2/COX2 発現細胞ニッチを誘導する可能性があるという二分法を示唆しており、これは TME 内の不均一性に起因する可能性があります。この仮説を調査するために、IFNγ を産生する CD8+ T 細胞と腫瘍 NOS2/COX2 発現細胞の間の空間的近接性と関係を、21 の ER 乳房腫瘍 (TNBC (n = 14) および HER2/neu+ (n = 7) を含む) で調べました。 ) 表現型) を多重空間イメージングを使用して解析します。蛍光イメージングにより、単一細胞レベルでの細胞近傍の視覚化と定量化が可能になります。図3Aに示すように、NOS2およびCOX2を高発現する細胞がTMEの異なる領域で観察されました。腫瘍全体の空間分布および密度ヒートマップ解析により、NOS2、COX2、および CD8+ T 細胞の異なる領域が明らかになり、NOS2 発現細胞と COX2 発現細胞 (図 3B、C) が別々の近傍で観察されました。さらに、NOS2 発現細胞の近くではより高い CD8+ T 細胞密度が観察されましたが、COX2 発現クラスターの近くではより低い密度が確認されました (図 3B、C)。したがって、悪性度の高い乳房腫瘍における CD8+ T 細胞と比較して、空間的に異なる NOS2 および COX2 発現細胞は、臨床転帰に影響を及ぼす CD8+ T 細胞とサイトカイン誘導性の NOS2/COX2 ニッチとの関連を示唆しています。

NOS2 (赤)、COX2 (緑)、CKSOX10 (青)、CD8+ T 細胞 (マゼンタ)、および DAPI (白) を示す、ER-/HER2 + 乳房腫瘍の多重蛍光。 B NOS2、COX2、または CD8+ T 細胞の空間分布 (左) と密度ヒートマップ (右)。空間分布は、量に関係なく、直径 25 μm の領域内のマーカーの陽性検出を反映しています。密度ヒートマップは、バイオマーカータンパク質発現の色グラデーション (低-高) 青、緑、黄、オレンジ、赤を反映した視覚的な定量を提供します。 NOS2/CD8、COX2/CD8、および NOS2/COX2 空間分布の組み合わせの C 比較。

ルーチン免疫組織化学 (IHC) グレード 1 ～ 4 によって以前に NOS2/COX2 高 (hi) または低 (lo) としてスコア付けされた ER 腫瘍における NOS2/COX2 発現 [7、9] を、次の時点での NOS2/COX2 蛍光強度について分析しました。多重蛍光イメージングを使用した単一細胞レベルの解析により、壊死、間質、生存腫瘍などの領域における単一細胞レベルの空間情報が得られます。生存腫瘍および間質領域は獣医病理学者によって H&E 画像 (QuPath) [21] に注釈が付けられ、HALO ソフトウェアを使用して NOS2/COX2 蛍光発現と融合されました (図 4A)。 HALO ソフトウェアのリアルタイム調整を使用して、各腫瘍の NOS2 および COX2 蛍光強度を決定し、平均強度と標準偏差 (SD) を決定しました。弱い、中程度、および強い発現レベルの閾値強度は、平均強度閾値設定にそれぞれ 2、4、または 6 SD を加えることによって決定されました。これらの閾値から定量化された腫瘍全体のNOS2 / COX2蛍光強度（補足図1A）は、以前に報告された元のIHC病理学者がスコア付けしたNOS2 / COX2発現レベルと一致していました[7、9]。腫瘍と間質を層別化すると、NOS2/COX2 高発現腫瘍では、強い/中程度のシグナル強度を伴う NOS2/COX2 腫瘍発現が大幅に上昇しました (補足図 1B)。対照的に、NOS2 の弱いシグナル強度は腫瘍ではなく間質で有意に上昇しましたが、COX2 の弱いシグナル強度は腫瘍では高くなりましたが、間質では上昇しませんでした（補足図 1B）。 NOS2 および COX2 のフィードフォワードシグナル伝達 [10] は、その発現を維持することが示されています。これらの腫瘍における腫瘍NOS2とCOX2の間の潜在的な線形関係をピアソンの相関係数を使用して調べたところ、強い、中程度、および弱い強度でのNOS2発現とCOX2発現の間に線形相関があることが明らかになりました（補足図1C）。これらの結果を総合すると、図 1A に示すように、また以前に報告された [10] ように、NOS2/COX2 フィードフォワードシグナリングが裏付けられます。

H&E 染色切片 (左) と連続蛍光画像 (右) を融合したもの。 H&E 切片は病理学者によって評価され、壊死 (紫)、生存可能な腫瘍 (緑色)、間質 (オレンジ) の領域が定義されました。腫瘍全体および腫瘍および間質における NOS2/COX2 発現細胞の割合が示されています。 B 1 (上)、2 (中)、3 (下) のラベルが付いた青いボックスで強調表示されている空間分布内の領域は、(1) 間質限定 CD8+ T 細胞の炎症領域から (2) 間質制限 CD8+ T 細胞の炎症領域への進行を反映しています。間質拘束性 CD8+ T 細胞、および (3) CD8+ T 細胞を欠く寒冷免疫砂漠腫瘍コア領域。これらの四角で囲った領域および CD8+ T 細胞または IFNγ における NOS2/COX2 発現の空間解析を 50 μm の倍率で示します。ボックス 1 に指定された炎症領域の登録画像は、NOS2 発現細胞 (赤色) の近くの C 間質拘束性 CD8+ T 細胞 (シアン) または D IFNγ 発現 (シアン) を示しています。ボックス 2 に指定された寒冷地域の分析では、E 限定 CD8+ T 細胞および F 限定 IFNγ で COX2 発現が高く、NOS2 発現が低いことが示されています。ボックス 3 に関連する免疫砂漠腫瘍コア領域の分析では、腫瘍 COX2 発現が高く、G CD8 + T 細胞レベルが低下し、H が IFNγ 発現を低下させていることが示されています。

図 4A は、腫瘍領域および間質領域だけでなく腫瘍全体でも腫瘍 NOS2/COX2 発現が上昇しており、%cell が大幅に増加していることを示しています。 NOS2 および COX2 の空間分布をさらに調べると、NOS2+ 細胞が腫瘍の縁または間質に集中していることが明らかになりました (図 4B ～ D)。 COX2 発現は一部の領域で NOS2 発現細胞の近くで観察されましたが、COX2+ 細胞は腫瘍中心部のさらに深い別個の領域および腫瘍の免疫砂漠領域に密集していました (図 4E-H)。 NOS2lo/COX2loとしてスコア付けされた腫瘍は、散発的な低密度NOS2およびCOX2病巣を示し、高強度病巣はほとんどまたはまったく観察されませんでした。対照的に、NOS2hi/COX2hi 腫瘍は、腫瘍間質界面に NOS2 クラスターを伴う、空間的に異なる高発現 NOS2 および COX2 病巣を多数示しました (図 4C、D)。対照的に、ボックス 2 ～ 3 は、COX2 クラスターが腫瘍中心部のさらに深くまで広がっていることを示しています (図 4E ～ H)。したがって、NOS2 および COX2 発現細胞は、腫瘍の異なる炎症領域に空間的に局在しています。

図２および図３に示すように。 1Dおよび2Cに示すように、MB231サイトカイン処理細胞における最適なNOS2/COX2発現にはIFNγが必要である。 CD8+ T細胞を含むリンパ系細胞は、IFNγ分泌源です[20]。最近の研究では、TNBC における生存率の向上には CD8+ T 細胞の空間的配向が重要な役割を果たしていることが実証されています [22]。腫瘍核への CD8+ T 細胞の浸透は、完全に炎症を起こした腫瘍を定義し、TNBC 患者の生存率の向上を予測しました [22]。対照的に、腫瘍中心部への CD8+ T 細胞の浸透が限られている (100 CD8+ T 細胞/mm2 以下) または間質限定 CD8+ T 細胞は、線維化または免疫抑制性の腫瘍免疫微小環境と関連しており、生存率の低下が予測されます [22]。したがって、CD8+ T 細胞の空間的局在化は臨床転帰の予測因子となります [22]。補足図 2 は、すべての腫瘍における CD8+ T 細胞の存在に対する NOS2/COX2 の強い単一細胞強度の分類を示しています。 CD8+ T 細胞の空間的局在の予測力 [22] を考慮すると、腫瘍 NOS2 発現の上昇に近い領域で IFNγ 発現の増加 (図 4D) を伴う間質限定 CD8+ T 細胞 (図 4C) が豊富に観察され、潜在的な関連性が示されました。 CD8+ T 細胞、IFNγ、および NOS2 制御の間の制御 (図 4C、D)。対照的に、図 4E ～ H は、CD8+ T 細胞が制限されている領域、および IFNγ および NOS2 の発現が制限されている領域を示しています。重要なのは、COX2 がこれらの領域で高度に発現していることです (図 4E-H)。ピアソンの相関係数も決定され、腫瘍NOS2hi発現細胞とCD8+ T細胞/INFγとの間の有意な相関が示されました（補足図3A）。興味深いことに、CD8+ T細胞/IFNγと腫瘍COX2発現の間に有意な直線性は観察されませんでした（補足図3B）。これらの結果は、CD8+ T 細胞が IFNγ の供給源を提供し、腫瘍 NOS2 発現の増加につながる可能性があることを示唆しています。

NO による発癌経路の刺激は、上皮間葉移行 (EMT)、遊走、および癌細胞の運動性の増加によって特徴付けられ、最終的に癌疾患の進行と転移を引き起こします [23、24]。このコホートの患者は、診断時にリンパ節陽性状態が観察されなかったにもかかわらず、転移性疾患により死亡した。 NOS2hi 領域は間質制限 CD8+ T 細胞の近くにありました。 NOS2hi 領域は、原発巣 (サテライト症) から離れたように見える小さな腫瘍クラスターを示し、転移性ニッチを示しました (図 5A ボックス 1、5B、および 5C)。対照的に、腫瘍NOS2発現が低く、CD8+ T細胞およびIFNγが少ない領域ではサテライト症は存在しなかった(図5D、E)。これらの発見は、NOS2hi クラスタリング病巣が転移能の増加を促進する可能性があることを示しており、これは以前の報告 [15、25] と一致しています。

A 腫瘍全体の空間分布。1（上）、2（中）、3（下）とラベル付けされた青いボックス。B、CはNOS2（赤）と腫瘍マーカーCKSOX10（青）発現細胞の空間局在の拡大を示す。ボックス 1 内で強調表示されている NOS2hi 領域 (50 μm) にあります。大きな病変から離れた伸長およびクラスター化した NOS2 発現細胞の両方が示されており、サテライト症と転移能の増加を示しています。これらの表現型は、寒冷免疫領域 (D) や免疫砂漠領域 (E) では観察されません。

細胞の形態は転移の重要な側面であり、細胞は遊走および浸潤の過程で伸長した表現型を獲得します。 in vitro 遊走モデルでは、転移過程における NO の役割が示されており、より高い NO フラックス（100 ～ 300 nM）に 24 ～ 48 時間曝露すると、MB231 および MB468 乳がん細胞の in vitro 遊走と浸潤が増加しました [7、15]。これらの初期の観察は、腫瘍の NOS2 発現とクラスター化の増加により、そのニッチ内の露出した細胞の転移能を高める NO の流入を生成することを示唆しています [15]。ここでは、細胞形態の変化に対する腫瘍細胞の NOS2/COX2 発現の影響をさらに調査しました。図6A、Bに示すように、個別または組み合わせのサイトカイン処理に曝露されたMB231細胞は、遊走細胞および浸潤細胞においてEMTに特徴的な形態学的変化および細胞伸長を示した。さらに、スクラッチテストアッセイでは、未処理の対照細胞と比較した場合、IFNγ + TNFα併用治療の12時間後に創傷閉鎖の増加が示されました(図6C)。同様に、ボイデンチャンバーアッセイでは、48 時間の IFNγ + TNFα 併用治療に応答して細胞浸潤の増加が示されましたが、これは汎 NOS/COX 阻害剤 (LNAME/インドメタシン) の単独治療薬および併用治療薬の両方によって減少しました (図 6D)。これらの結果は、炎症ニッチ内での NOS2/COX2 腫瘍発現の上方制御により、転移能が増加した表現型を生成する可能性があることを示唆しています (図 6)。

A コントロールおよびサイトカイン処理した MB231 細胞の 48 時間の顕微鏡画像 (10 倍)。 B 48 時間のサイトカイン処理後の細胞伸長分析。 12時間のサイトカイン処理後のMB231細胞のCAスクラッチテストアッセイ。 D 細胞浸潤アッセイ; MB231細胞を、無血清培地±サイトカインおよび汎NOS/COX阻害剤LNAMEおよびインドメタシンを含むボイデンチャンバーの上部ウェルに48時間播種した。下部チャンバーは完全な培地で満たされました。細胞を標準曲線に対してカウントした。結果は平均値 ± SD として表示されます。 *p < 0.05、**p < 0.001、***p < 0.0001。

ER 乳がんの最も効果的な予後指標の 1 つは、NOS2 と COX2 の関連性です [10、26]。上記のデータは、図 7 に要約されているように、臨床転帰の観点から IFNγ とリンパ細胞との間に異常な関連性があることを示しています。IFNγ と CD8+ T 細胞は、高い NOS2 および COX2 レベルの産生に関連しており、それらの産生に必要であるという事実にもかかわらず、は良好な臨床転帰を予測し、多くの悪性腫瘍における良好な予後の特徴となる[22、27]。 scRNAseq の結果によると、最高レベルの NOS2 および COX2 発現を誘導するには IFNγ および IL1β/TNFα が必要であり、リンパ球が腫瘍の一因となっている可能性があることが示唆されています。以前の研究によると、IFNγはDLD1（ヒト結腸癌）細胞におけるNOS2の刺激に重要である[28]。また、IFNγ + IL1β を含む MB231 の scRNAseq は、NOS2/COX2 と IL1β、TNFα、IL6、IL8 との間の強い関連性を明らかにし、TCGA から得られた強化された Th1 微小環境の概念を裏付けています (図 1)。これは、NOS2/COX2 を高発現する細胞ニッチと疾患の進行の誘導を促進するフィードフォワードループにつながる多因子免疫機構を示唆しています。以前の研究では、IFNγ、IL6、PGE2、およびIL1がすべてNOS2発現を促進することが実証されており、いくつかの強化プロセスがNOS2アップレギュレーションに関与していることが示唆されています[15]。さらに、IL1α は、化学療法後の TME で頻繁に観察される ER ストレスのメディエーターです。 IFNγおよびIL1βに応答して増加したIL1αとILβは両方とも、NOS2/COX2メカニズムの持続的上昇のためのこれらの相補的経路を大幅に強化します。これらの要因が共謀して、疾患の進行を促進する NOS2/COX2 炎症ニッチを作り出す可能性があります。

間質制限型 CD8+ T 細胞による IFNγ の分泌と、腫瘍微小環境内の骨髄細胞によって分泌される IL1β/TNFα は、腫瘍 NOS2/COX2 発現と転移能の増加を伴う攻撃的な細胞ニッチの発達をもたらし、免疫抑制を促進します。次に、腫瘍NOS2/COX2を高発現している細胞近傍ではIL1α/βが増加し、腫瘍NOS2/COX2発現とIL8やIL-6を含むサイトカインの上昇、およびNOによる潜在的なTGFβの活性化を維持するフィードフォワードループが形成されます。これらの因子は共謀して、NOS2 由来の NO および COX2 由来の PGE2 を介して免疫抑制、転移、および癌の幹細胞性を促進します。

タンパク質の配列と生化学はマウスとヒトで同等であるにもかかわらず、NOS2 プロモーターは複雑であり、2 つの種間で大きく異なります [28、29、30]。 IFNγ または LPS によって in vitro で最大限に誘導されるマウスマクロファージにおける NOS2 の発現は、NO 分野のゴールドスタンダードであり、推定される NO フラックスは細胞レベルで 1 ～ 5 μM にも達する可能性があります [13]。マウスの腫瘍細胞は、IFNγ または LPS に応答して著しく高い NOS2 活性を示し、これは腫瘍細胞とマクロファージの重要な違いを示唆しています [13]。ここでのデータは、ヒト NOS2 の最大発現が IFNγ、IL1β、および TNFα によって誘導されることを明確に示しており、これはマウス腫瘍細胞におけるものと同じですが、ヒトマクロファージは IFNγ または LPS によって NOS2 を活性化しません。しかし、マウスとヒトの腫瘍細胞によって産生される NO のレベルは、依然として基本的なレベルで大きく異なります。最近、NOS2 発現ではなく NOS2+ 細胞の数が、in vitro で生成される NO および亜硝酸塩の量と相関していることが実証されました [11]。その結果、NOS2 発現細胞のクラスターは NO レベルに影響を及ぼし、NOS2 細胞のクラスター化により NO フラックスがより大きい領域が生成される可能性があります [13、31]。インビトロ実験では、細胞の 50 ～ 80% が NOS2 を発現し、フラックスが 100 nM を超える場合、亜硝酸塩と NO のレベルが高くなることが明らかになりました。しかし、ヒトの癌の 5% では NO 生成が 1 桁低くなります。私たちの以前の研究は、NO による発がん経路が 200 ～ 400 nM の理想的な濃度で起こり、IL6 と IL8 の発現を増加させることを示しています [12]。それにもかかわらず、腫瘍内の局所的な病巣など、NOS2 発現細胞がはるかに高い密度で集中している場所では、NO レベルが高くなります。総合的に考えると、これらの発見は、高密度 NOS2 発現細胞のこれらの領域ではより大きな NO フラックスがあり、ペトリ皿内で 100 ～ 300 nM の NO の範囲で起こる発癌メカニズムを引き起こす可能性があることを示唆しています [32,33,34] ]。

CD8+ T 細胞と IFNγ が豊富な領域は、TME 内のリンパ系細胞と腫瘍細胞の並置に関連しており、その結果、増強された NOS2 発現細胞が高度にクラスター化されます。 CD8+ T 細胞の配置を調べた以前の研究では、空間的配向が TNBC の臨床転帰の決定において重要な要素であることが実証されました [22]。陽性結果は、完全に炎症を起こした腫瘍の腫瘍中心部まで CD8+ T 細胞が腫瘍に浸透することによって説明されます。一方で、間質限定 CD8+ T 細胞および CD8+ T 細胞が欠如した免疫砂漠領域では、臨床転帰が不良となることが予測されます [22]。今回我々は、高い NOS2 細胞ニッチが腫瘍の縁と間質制限 CD8+ T 細胞の近位に形成される可能性があることを実証します。これらのニッチは、腫瘍の NOS2/COX2 発現を誘導する IFNγ やその他のサイトカインに遭遇する可能性があります。反対に、NOS2+ 細胞と COX2+ 細胞は散在しており、腫瘍への CD8+ T 細胞の浸透が増加している領域では低レベルで観察されます。前述の情報は、CD8+ T 細胞と IFNγ が NOS2 に近いことを明白に示しており、間質制限 CD8+ T 細胞による炎症ニッチが NOS2 誘導に必要であることを示唆しています。

CD8+ T 細胞が欠如している免疫砂漠は、以前に特定されている TME のもう 1 つの重要な側面です [22]。低い臨床転帰は、腫瘍区画内の CD8+ T 細胞数の低下と消耗した CD8+ T 細胞によって示唆されます [35]。免疫砂漠地域における IFNγ の低下に関連する CD8+ T 細胞の欠如における重要な要因の 1 つは、COX2 発現が増加した NOS2 欠損地域でも明らかになりました。これは、免疫砂漠が COX2 陽性領域と NOS2 陰性領域に関連していることを意味します。腫瘍間質または辺縁に限定される CD8+ T 細胞およびその他のリンパ系細胞の上昇は、NOS2 および COX2 の上昇を促進する状況を引き起こす可能性があります。

私たちの以前の研究では、EMT と転移の促進に NO が不可欠であることが実証されました [15]。これらの NOS2 病巣で炎症が増加すると転移の可能性が高まり、腫瘍間質界面での NOS2 陽性ニッチの発見は、これが転移部位である可能性を示唆しています。 NO によって誘発される伸長と EMT は、これらの効果を媒介することが知られています [15]。また、IL1 と PGE2 は、乳がんにおける EMT と細胞運動性を強化します [36、37]。ここで、IFNγ と ILβ1/TNFα は運動性と伸長を促進します [7]。その結果、NOS2/COX2 炎症ニッチは、がん細胞の運動性と転移の広がりの可能性を高めます。したがって、限られた転移能は、NOS2/COX2 フィードフォワードループの阻害によって達成できます [38]。転移が癌死の主な原因であることを考えると、これらの炎症部位における NOS2/COX2 の空間的局在は、リンパ節陽性状態がない場合でも予後不良の早期予後指標を提供する可能性があります [7]。

IFNγは、炎症誘発性抗腫瘍免疫反応の誘導において重要な役割を果たしています[39]。しかし、最近の研究では、IFNγ応答は濃度依存性であり、TME中の低レベルが主要組織適合複合体の下方制御とインドールアミン2,3-ジオキシゲナーゼおよびプログラム細胞死リガンド1の上方制御を部分的に介して腫瘍原性疾患の進行を促進することが示されている[39]。。さらに、IFNγは腫瘍特異的なNOS2/COX2発現を刺激するために必要であり、これは多面的なプロセスを通じて発がん経路を促進し、予後不良に関連する免疫学的プロファイルを形成します[10、11]。 IFNγ が細胞溶解性 CD8+ T 細胞によって分泌されることを考えると、空間分析は、CD8+ T 細胞の量と位置 [22] が、腫瘍 NOS2/COX2 発現の上方制御や、疾患の進行、転移、および不良な臨床転帰を促進するニッチの発達[7、10、11、22]。

MDA-MB231 (MB231) ヒト乳がん細胞株は、American Type Culture Collection (ATCC、バージニア州マナサス) から入手し、10% ウシ胎児血清 (FBS; Invitrogen、Waltham、米国) を補充した RPM1-1640 (Invitrogen) で増殖させました。 MA) 空気中の 5% CO2 の加湿雰囲気下、37 °C で。実験前に、細胞を一晩血清飢餓状態にしました。下流のアッセイに応じて、細胞を ddH2O (コントロール)、IFNγ 100 U/mL (285-IF/CF、R&D Systems、ミネアポリス、ミネソタ州)、IL1β 10 ng を添加して 12、24、または 48 時間インキュベートしました。 /mL (201-LB/CF、R&D Systems)、TNFα 10 ng/mL (210-TA/CF、R&D Systems)、IL17A 10 ng/mL (7955-IL-CF、R&D Systems)、リポ多糖 (LPS、Sigma) 、セントルイス、ミズーリ州）１０ｍｇ／ｍＬ（Ｌ２６３０、シグマ）、ＬＮＡＭＥ５００ｍＭ（Ｎ５７５１、シグマ、ミズーリ州セントルイス）、および／またはインドメタシン１００μＭ（Ｉ７３７８、シグマ、ミズーリ州セントルイス）。

100 万個の細胞を 60 mm ディッシュに播き、100% コンフルエントに到達させました。２００μｌのピペットチップを使用して、コンフルエントな単層を横切る直線のスクラッチラインをエッチングした。 1X PBS でディッシュを洗浄することによって浮遊細胞と死細胞を除去し、その後完全培地を添加しました。 10 倍対物倒立顕微鏡 (EVOS、Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド) を使用して、0、4、8、および 12 時間の時点で画像を撮影しました。オープンソースソフトウェア ImageJ は、スクラッチギャップが補充されるペースを測定しました (バージョン 1.53 u) [40]。

Abcam (Waltham, MA) の 96 ウェルプレート形式の細胞浸潤アッセイ (カタログ番号 ab235697) を使用しました。細胞の同期後、完全培地を誘引剤として下部チャンバーに与え、50,000 個の細胞をサイトカイン±阻害剤とともに上部チャンバーに 48 時間播種しました。遊走した蛍光細胞を、SpectraMax i3x プレートリーダー (Molecular Devices、カリフォルニア州サンノゼ) で Ex/EM = 530/590 nm で計数し、同じ細胞株から作成した標準曲線と比較しました。

単一細胞ライブラリーは、10x Genomics (カリフォルニア州サンフランシスコ) の Single Cell 3' Reagent Kit v3 を使用して生成され、その後、当社の配列決定施設 (メリーランド州フレデリックの NCI) で Illumina NovaSeq 6000 を使用して配列決定されました。懸濁培地中のサンプル細胞ライブラリーの調製前に生存率を検査しました。 cDNA は、ライブラリーの調製中にバーコード化され、プールされ、増幅された後に配列決定されました。平均して、サンプルあたり 10,000 個の細胞が配列決定されました。 Cell Ranger ソフトウェアは、生の読み取り値を入力として提供しました (10x Genomics、バージョン 6.1.2)。これらは、Cell Ranger を使用して逆多重化され、BCL ファイルに変換されました。すべての読み取り値は、品質チェック (GRCH38-30.0) に合格した後、デフォルトの 10x ゲノミクスパイプライン (バージョン 3.1.0) を使用してヒト参照ゲノムにマッピングされました。各セル内の注釈付き転写カウントを使用して、UMI (Unique Molecular Identifier) カウント行列を構築しました。

各サンプルのマトリックス h5 ファイルは、データ処理とデータマイニングのために社内の Partek (ミズーリ州セントルイス) の Flow サーバーにアップロードされました。すべてのカウントは、デフォルトの「100 万あたりのカウント、1 を追加、log2 変換」方法を使用して正規化されました。次に、GSA (遺伝子特異的分析) ツールを適用して、さまざまな実験サンプル間で差次的に発現している遺伝子を発見しました。絶対倍率変化 ≥2 および ap 値 <0.05 を使用して遺伝子を選択しました。 Loupe Browser (バージョン 6.3.0、10x Genomics) を利用して、集約されたスタンドアロンデータセットを視覚的に検査し、scRNAseq データのクラスタリングパターンを分析しました。相関ヒートマップを作成するために、Cell Ranger の出力から Seurat (バージョン 4.0、Satija lab、https://satijalab.org/seurat/) で直接処理された scRNAseq データセットを RStudio (2022.07.2 Build 576、https) にエクスポートしました。 ://posit.co/) を並行して実行します。単一細胞データは、対応著者へのリクエストに応じて入手可能です。

TCGA の乳がん (BRCA) サブセット (https://www.cancer.gov/about-nci/organization/ccg/research/structural-genomics/tcga) は、UCSC (カリフォルニア大学サンタクルーズ校) Xena を通じてアクセスされました。ブラウザ (アクセス日: 2022 年 11 月 2 日、https://xena.ucsc.edu/)。簡単に説明すると、対象となるすべての Th1、Th2、Th17 サイトカイン、NOS2、および COX2 遺伝子が Xena ブラウザーで調査され、その後の相関分析のために RStudio (2022.07.2 Build 576) にエクスポートされました。

腫瘍標本 (n = 21) は、1993 年から 2003 年の間にメリーランド大学 (UMD) メディカルセンター、ボルチモア退役軍人医療センター、ユニオン記念病院、マーシーメディカルセンター、およびボルチモアのサイナイ病院で募集された乳がん患者から採取されました。すべての患者からインフォームドコンセントを得た。腫瘍標本、調査データ、臨床および病理学的情報の収集 (UMD プロトコル番号 0298229) は、参加施設の UMD 治験審査委員会 (IRB) によって審査され、承認されました。この研究は、NIH 人体研究局によっても審査され、承認されました (OHSR no. 2248)。乳房腫瘍の NOS2 および COX2 発現は、1:250 希釈の NOS2 抗体および 1:50 希釈の COX2 抗体 (それぞれ番号 610328 および 610204、BD Biosciences、カリフォルニア州サンディエゴ) を使用して IHC によって事前に分析され、病理学者によってスコア付けされました [7、 9]。 NOS2 染色の場合、強度と分布の組み合わせスコアを使用して免疫組織化学的 NOS2 染色を分類し、染色が陰性、弱い、中程度、または強い場合、強度は 0 ～ 3 のスコアを受け取りました。 NOS2 分布では、陽性細胞の分布 <10%、10 ～ 30%、>30 ～ 50%、>50 ～ 80%、および >80% について 0 ～ 4 のスコアが与えられました [7]。 COX2 染色の場合、陰性から弱 [1、2] または中程度から強 [3、4] のスコアは、それぞれ低または高として分類されました [9]。ここで、NOS2 および COX2 の発現は、Post Primary Block 試薬 DAB を省略し、Bond Polymer Refine Kit (Leica Biosystems DS9800) を使用して Leica Biosystems (Wetzlar、ドイツ) Bond RX Autostainer XL ST5010 で実行される蛍光染色によっても分析されました。そしてヘマトキシリン。 EDTA (Bond Epitope Retrieval 2) による抗原回復後、切片を COX2 (Cell Signaling Technology、マサチューセッツ州ダンバーズ、番号 12282、1:100) とともに 30 分間インキュベートし、続いてポリマー試薬および OPAL Fluorophore 520 (AKOYA、マサチューセッツ州マールボロ）。 COX2 抗体複合体を Bond Epitope Retrieval 2 で加熱することにより除去しました。その後、切片を NOS2 抗体 (Abcam no. ab15323、1:50) と 30 分間インキュベートし、続いてポリマー試薬および OPAL Fluorophore 690 とインキュベートしました。NOS2 抗体複合体はBond Epitope Retrieval 2 で加熱して剥離し、CD8 (Abcam no. 101500、1:100) または IFNγ (Abcam no. 231036、1:200) で染色し、続いてポリマー試薬と OPAL Fluorophore 570 で染色しました。 DAPI と Prolong Gold Anti-Fade Reagent (Invitrogen) でカバースリップをかけました。画像は、Aperio ScanScope FL ホールスライドスキャナー (Leica) を使用して取得されました。以前に報告された元の IHC [7、9] と蛍光 NOS2/COX2 染色の結果は概ね一致していました。

ホルマリン固定パラフィン包埋 (FFPE) 組織を 4 μm で切片化し、SuperFrost Plus スライドに載せたものを、FixVUE Immuno-8TM キット (以前は UltiMapper® キットと呼ばれていました (Ultivue Inc.、マサチューセッツ州ケンブリッジ)、米国; CD8) で染色しました。、NOS2、COX2、CKSOX10、および IFNγ カクテル）を抗体結合 DNA バーコード多重免疫蛍光 (mIF) 法を使用して使用します [1]。これらのキットには、アッセイを実行するために必要な緩衝液および試薬（抗体希釈液、前増幅ミックス、増幅酵素および緩衝液、蛍光プローブおよび対応する緩衝液、核対比染色試薬）が含まれています。ヘマトキシリンおよびエオシン (H&E) および mIF 染色は、Leica Biosystems BOND RX Autostainer を使用して実行されました。 mIF 染色を行う前に、BOND RX にロードする前に、FFPE 組織切片を 60 ～ 65 °C で 30 分間垂直にベーキングして余分なパラフィンを除去しました。 BOND RX を使用して、推奨される FixVUE (UltiMapper) プロトコルでスライドを染色しました。アッセイのセットアップ中に、キットの試薬が準備され、ライカ滴定コンテナ内の自動染色装置にロードされました。エピトープ回復用のソリューション (ER2、Leica Biosystems カタログ番号 AR9640)、BOND Wash (Leica Biosystems カタログ番号 AR9590)、および他のすべての BOND RX バルク試薬は Leica から購入しました。このアッセイ中、サンプルは最初に 4 つすべての抗体複合体の混合物とともにインキュベートされ、次に各ターゲットの DNA バーコードが同時に増幅されてアッセイの感度が向上しました。次に、相補的 DNA バーコードと結合した蛍光プローブをサンプルに添加して、標的を結合して標識します。次に、穏やかなシグナル除去ステップを使用して、マーカーの蛍光プローブを除去しました。染色されたスライドを Prolong Gold Anti-Fade 封入剤 (Thermo Fisher Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム、カタログ番号 P36965) にマウントし、カバースリップをかけました (Fisherbrand Cover Glass 22 × 40 mm、#1.5)。デジタル免疫蛍光画像は 20 倍の倍率でスキャンされました。 Ultivue UltiStacker ソフトウェアで同時登録およびスタックされ、HALO 画像解析プラットフォーム [41] を使用してデジタル画像が解析されました。

特に明記しない限り、実験は３回繰り返してアッセイした。 GraphPad Prism ソフトウェア (バージョン 9) を使用して、統計的有意性を評価するためにスチューデント t 検定を採用しました。画像分析は平均±SEMとして報告され、有意性を決定するために適切な場合にはウェルチ補正またはマン・ホイットニー補正を伴うT検定が使用されました。線形解析およびピアソン相関も、Prism ソフトウェアを使用してタンパク質発現間の有意な相関を決定するために実行されました。有意性は、*p ≤ 0.05、**p ≤ 0.01、***p ≤ 0.001、および ****p ≤ 0.0001 として報告されます。単一セル相関分析は、R (4.2.1) の corrplot (0.92) を使用して RStudio で実行されました。

単一細胞の RNAseq データは、ご要望に応じて提供されます。

Putti TC、El-Rehim DM、Rakha EA、Paish CE、Lee AH、Pinder SE、他。エストロゲン受容体陰性乳癌：形態学および免疫表現型分析のレビュー。モッドパソル。 2005;18:26–35。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Poddar A、Rao SR、Prithviraj P、Kannourakis G、Jayachandran A. トリプルネガティブ乳がんにおける免疫チェックポイント調節因子、代謝再プログラミング、および細胞可塑性間のクロストーク。カーオンコル。 2022;29:6847–63。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

トーマスDD、ウィンクDA。がんの進行における新興プレイヤーとしての NOS2。抗酸化酸化還元シグナル。 2017;26:963–5。

論文 CAS PubMed Google Scholar

カルヴァーリョ LAC、ケイホ RG、バッカロ ALB、シエナ ADD、シルバ WA、ジュニア、ロドリゲス T、他黒色腫の進行における酸化還元関連タンパク質。酸化防止剤。 2022;11:438。

Douguet L、Bod L、Labarthe L、Lengagne R、Kato M、Couillin I、他。炎症はガンマデルタ T 細胞による一酸化窒素シンターゼ 2 の発現を促進し、黒色腫と白斑関連黒色腫の間のバランスに影響を与えます。オンコイン免疫学。 2018;7:e1484979。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

パルンボ P、ロンバルディ F、アウジェッロ FR、ジュスティ I、ルッツィ S、ドーロ V 他 NOS2 阻害剤 1400W オートファジーフラックスを誘導し、ヒト神経膠芽腫 U87MG 細胞株の細胞外小胞プロファイルに影響を与えます。 Int J Mol Sci. 2019;20:3010

Glynn SA、Boersma BJ、Dorsey TH、Yi M、Yfantis HG、Ridnour LA、他。 NOS2 の増加は、エストロゲン受容体陰性乳がん患者の生存率の低下を予測します。 J クリンインベストメント 2010;120:3843–54。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

チェン RYS、バーケット S、アンブス S、ムーディー T、ウィンク DA、リドナー LA。一酸化窒素への慢性的な曝露は、ヒト乳房上皮細胞に P53 変異と悪性腫瘍のような特徴を誘発します。生体分子。 2023;13:311。

Glynn SA、Prueitt RL、Ridnour LA、Boersma BJ、Dorsey TM、Wink DA、他。 COX-2 の活性化は、Akt のリン酸化と、ER 陰性、HER2 陽性の乳がんにおける生存率の低下に関連しています。 BMCがん。 2010;10:626。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D、Glynn SA、Greer M、Somasundaram V、No JH、Scheiblin DA、他。 NOS2 と COX2 の共発現は腫瘍の増殖を促進し、エストロゲン受容体陰性乳がんの生存率を低下させます。 Proc Natl Acad Sci USA。 2017;114:13030–5。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Somasundaram V、Ridnour LA、Cheng RY、Walke AJ、Kedei N、Bhattacharyya DD、他。全身的な Nos2 枯渇と Cox 阻害は、TNBC 疾患の進行を制限し、リンパ球細胞の空間的配向と密度を変化させます。レドックスバイオル。 2022;58:102529。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D、Bharadwaj G、Somasundaram V、Cheng RYS、Ridnour LA、Fujita M、他。 NOS2/COX2の観点から腫瘍微小環境通信ネットワークを理解する。 Br J Pharm. 2019;176:155–76。

記事 CAS Google Scholar

Somasundaram V、Gilmore AC、Basudhar D、Palmieri EM、Scheiblin DA、Heinz WF、他。誘導性一酸化窒素シンターゼ由来の細胞外一酸化窒素フラックスは、単細胞レベルで炎症誘発性反応を調節します。レドックスバイオル。 2020;28:101354。

論文 CAS PubMed Google Scholar

アンジェローニ V、ティベリオ P、アッピエルト V、ダイドン MG。治療に対する乳がん反応におけるステムネス関連シグナル伝達経路の影響。セミンガンバイオール。 2015;31:43–51。

論文 CAS PubMed Google Scholar

ハイネッケ JL、リドノール LA、チェン RY、スイス CH、リザード MM、カンナ C 他乳がんの進行における腫瘍微小環境に基づく NOS2 のフィードフォワード制御。 Proc Natl Acad Sci USA。 2014;111;6323–8。

Takawale A、Zhang P、Patel VB、Wang X、Oudit G、Kassiri Z. マトリックスメタロプロテイナーゼ 1 の組織阻害剤は、CD63 とインテグリンベータ 1 の相互作用を媒介することによって心筋線維症を促進します。高血圧。 2017;69:1092–103。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Wu TC、Xu K、Martinek J、Young RR、Banchereau R、George J 他 IL1 受容体アンタゴニストは、転移性乳がん患者の炎症の転写サインを制御します。がん研究所 2018;78:5243–58。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun X、Zhai J、Sun B、Parra ER、Jiang M、Ma W 他エフェクター記憶細胞傷害性 CD3(+)/CD8(+)/CD45RO(+) T 細胞は、トリプルネガティブ乳がんにおける良好な生存率と再発リスクの低下を予測します。モッドパソル。 2022;35:601–8。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Zhang G、Xu Q、Zhang X、Yang M、Wang Y、He M 他腫瘍内の空間細胞傷害性 T 細胞とメモリー T 細胞は、高悪性度漿液性卵巣がん患者の優れた生存転帰を予測します。がん医学。 2021;10:3905–18。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Prizment AE、Vierkant RA、Smyrk TC、Tillmans LS、Nelson HH、Lynch CF、他。細胞傷害性T細胞とグランザイムBは、高齢女性の前向きコホートにおける結腸直腸がん生存率の改善と関連していた。がんエピデミオールバイオマーク 2017;26:622–31。

記事 CAS Google Scholar

Bankhead P、Loughrey MB、Fernandez JA、Dombrowski Y、McArt DG、Dunne PD、他。 QuPath: デジタル病理画像解析用のオープンソースソフトウェア。 Sci Rep. 2017;7:16878。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Gruosso T、Gigoux M、Manem VSK、Bertos N、Zuo D、Perlitch I 他空間的に異なる腫瘍免疫微小環境により、トリプルネガティブ乳がんが階層化されます。 J クリンインベストメント 2019;129:1785–800。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Basudhar D、Somasundaram V、de Oliveira GA、Kesarwala A、Heinecke JL、Cheng RY、他。一酸化窒素シンターゼ 2 由来の一酸化窒素は、乳がん進行の複数の経路を促進します。抗酸化酸化還元シグナル。 2017;26:1044–58。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wink DA、Ridnour LA、Cheng R、Switzer CW、Glynn S、Ambs S。ER(-) 乳がんにおけるレドックス炎症性タンパク質誘導性一酸化窒素シンターゼの発癌特性。レドックスバイオル。 2015;5:413。

論文 PubMed Google Scholar

グラナドス校長 S、劉 Y、ゲバラ ML、ブランコ E、チョイ DS、銭 W、他トリプルネガティブ乳がんに対する新規の効果的な標的療法としての iNOS の阻害。乳がん研究所 2015;17:25。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ウォルシュ EM、キーン MM、ウィンク DA、キャラジー G、グリン SA。トリプルネガティブ乳がんと、腫瘍生物学および患者の転帰に対する誘導性一酸化窒素シンターゼの影響のレビュー。クリティカル・レブ・オンコグ。 2016;21:333–51。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Sun S、Zhi Z、Su Y、Sun J、Li Q。黒色腫の予後および免疫療法効果を予測するための CD8+ T 細胞関連免疫遺伝子パネル。フロントイミュノール。 2022;13:1039565。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kleinert H、Wallerath T、Fritz G、Ihrig-Biedert I、Rodriguez-Pascual F、Geller DA、他。ヒト DLD-1 細胞における NO シンターゼ II のサイトカイン誘導: JAK-STAT、AP-1、および NF-κB シグナル伝達経路の役割。 Br J Pharm. 1998;125:193–201。

記事 CAS Google Scholar

Hoos MD、Vitek MP、Ridnour LA、Wilson J、Jansen M、Everhart A、他。 NOS2 遺伝子発現におけるヒトとマウスの違いが脳の酸化還元および免疫環境に及ぼす影響。モル神経変性者。 2014;9:50。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

サモラ R、ヴォドヴォッツ Y、ビリアー TR。誘導性一酸化窒素合成酵素と炎症性疾患。モルメッド。 2000;6:347–73。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lancaster JR Jr. 内因的に生成された一酸化窒素の拡散と反応のシミュレーション。 Proc Natl Acad Sci USA。 1994;91:8137–41。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

スイス CH、チェン RY、リドナー LA、グリン SA、アンブス S、ウィンク DA。 Ets-1 は、エストロゲン受容体陰性乳がんにおける発がん性一酸化窒素シグナル伝達の転写メディエーターです。乳がん研究所 2012;14:R125。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Switzer CH、Glynn SA、Cheng RY、Ridnour LA、Green JE、Ambs S 他 EGFR および Src の S-ニトロシル化は、ヒト基底様乳がんにおける発がん性シグナル伝達ネットワークを活性化します。モルがん研究所。 2012;10;1203–15。

スイス CH、リドナー LA、チェン R、ハイネッケ J、バーク A、グリン S、他 S-ニトロソ化は、エストロゲン受容体陰性乳がんの腫瘍進行につながる複数の経路を仲介します。イムノパトールディスサー。 2012;3:117–24。

記事 Google Scholar

Egelston CA、Guo W、Tan J、Avalos C、Simons DL、Lim MH、他腫瘍浸潤によって疲弊した CD8+ T 細胞は、閉経前エストロゲン受容体陽性乳がんの生存率低下に影響します。 JCI の洞察。 2022;7:e153963

トゥロッタ C、レフリー DV、フリーマン K、グレゴリー WM、ハンビー AM、ヒース PR 他乳がん細胞による IL1B の内因性産生は、骨微小環境の転移と定着を促進します。臨床がん研究所 2019;25:2769–82。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Walker OL、Dahn ML、Power、Coombs MR、Marcato P. プロスタグランジン E2 経路と乳がん幹細胞: シグナル伝達の増加と潜在的なターゲティングの証拠。フロントオンコル。 2021;11:791696。

論文 PubMed Google Scholar

Chung AW、Anand K、Anselme AC、Chan AA、Gupta N、Venta LA、他。化学療法抵抗性のトリプルネガティブ乳がんを治療するための一酸化窒素合成酵素阻害剤 L-NMMA とタキサンの第 1/2 相臨床試験。科学翻訳医学。 2021;13:eabj5070。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Jorgovanovic D、Song M、Wang L、Zhang Y. 腫瘍の進行と退縮における IFN-ガンマの役割: 総説。バイオマーク研究所 2020;8:49。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

リャンCC、パークAY、グアンJL。インビトロスクラッチアッセイ：インビトロでの細胞遊走を分析するための便利で安価な方法。ナットプロトコル。 2007;2:329–33。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マネス M、パテル KK、ボブロウ M、ダウニング SR。多重免疫蛍光細胞表現型検査および腫瘍 FFPE サンプルの空間プロファイリングのための InSituPlex((R)) 染色法。方法ＭｏｌＢｉｏｌ． 2020;2055:585–92。

論文 CAS PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

このプロジェクトは、NIH、国立がん研究所、CCR、CIL (RYSC、LAR、ALG、ELF、HR、VS、RJK、SMH、DWM、SKA、SA) の学内研究プログラムからの連邦資金の全部または一部によって資金提供されました。、DAW）。このプロジェクトは、契約 HHSN261200800001E (ALW、WFH、MP、SKA、および SJL) およびフレデリック国立がん研究研究所の基礎科学プログラムに基づいて、国立衛生研究所のフレデリック国立がん研究研究所からの連邦資金の一部によって資金提供されています。、フレデリック、MD 21702 (SKA)。このプロジェクトは、サンパウロ研究財団 (FAPESP) 助成金 2018/08107-2 および 2021/14642-0 (MCR)、NIH R01CA238727、NIH U01CA253553、およびジョン S ダン研究財団 (STCW)、NCI 助成金 1 号によって一部資金提供されました。 U54 CA210181、乳がん研究財団 (BCRF)、モラン財団、治癒のための原因、M. ニールと R. ニールによる慈善支援、および科学財団の薬物再配置および開発プログラム (CREDO) センター (JCC)アイルランド (SFI) の助成金番号 17/CDA/4638、および SFI および欧州地域開発基金 (ERDF) の助成金番号 13/RC/2073 (SAG)。学生を海外に派遣してくださったサンパウロ研究財団 (FAPESP) に感謝します (LC)。この出版物の内容は必ずしも保健社会福祉省の見解や方針を反映するものではなく、商号、商品、または組織への言及は米国政府による承認を意味するものでもありません。

国立衛生研究所 (NIH) によって提供されるオープンアクセス資金。

Robert YS Cheng、Lisa A. Ridnour の著者も同様に貢献しました。

この作品は、Stephen J. Lockett、Stefan Ambs、David A. Wink の著者が共同で監修しました。

米国メリーランド州フレデリック、国立衛生研究所、国立がん研究所、がん研究センター、がんイノベーション研究所

ロバート・YS・チェン、リサ・A・リドナー、アナ・L・ゴンザレス、エリーズ・L・フェミノ、ヘレン・リッチャー、ヴィーナ・ソマスンダラム、ダニエル・W・マクヴィカー、スティーブン・K・アンダーソン、デヴィッド・A・ウィンク

光学顕微鏡および分析研究所、フレデリック国立がん研究所、米国メリーランド州フレデリック、国立がん研究所の Leidos Biomedical Research Inc.

アデレード・L・ウィンク、ウィリアム・F・ハインツ、スティーブン・J・ロケット

サンパウロ大学医学部、腫瘍学トランスレーショナル研究センター、ICESP/HC、ブラジル、サンパウロ、サンパウロ大学、精密腫瘍学総合センター

レアンドロ・コウチーニョ & M. クリスティーナ・ランジェル

分子組織病理学研究所、Leidos Biomedical Research Inc. for NCI、米国メリーランド州フレデリック

イライジャ・F・エドモンソン & ドナ・ブッチャー

米国メリーランド州フレデリック、NCIがん治療診断部門局長室

ロバート・J・チルドレン

米国ジョージア州アトランタ、エモリー大学病理学および検査医学科

リー・シャオシアン

米国テキサス州ヒューストン、ヒューストンメソジスト病院およびワイルコーネル医学、ヒューストンメソジストニールがんセンターシステム医学および生物工学部門

スティーブン・TC・ウォン

米国メリーランド州フレデリック、フレデリック国立がん研究研究所、がん研究技術プログラム、イメージングマスサイトメトリー研究所

ミリンドポア

病理学研究所 CCR、NCI、NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国

スティーブン・M・ヒューイット

ピッツバーグ大学医療センター外科、ペンシルバニア州ピッツバーグ、15213、米国

ティモシー・R・ビリアー

病理学分野、ランベトランスレーショナルリサーチ研究所、ゴールウェイ大学医学部、ゴールウェイ、アイルランド

シャロン・A・グリン

メアリーおよびロン・ニールがんセンター、ヒューストン・メソジスト病院およびワイル・コーネル・メディスン、米国テキサス州ヒューストン

ジェニー・C・チャン

ヒト発癌研究所、CCR、NCI、NIH、ベセスダ、メリーランド州、米国

ステファン・アンブス

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

RYSC と LAR: 論文を書き、実験を行い、データ分析を行いました。 ALW: 分析されたデータ。 ALG、ELF、LC、MP、SMH、および SA: 実験とデータ分析を実行しました。 HR、VS、DB: 実験を実施しました。 WFH、EFE、RJK、XL、STCW、DWM、SKA、TRB、SAG、JCC、および SJL: データ分析。 MCR: 試薬を提供しました。 DAW: 論文執筆とデータ分析。

デビッド・A・ウィンクへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

ピエール・ジョルジョ・マストロベラルディーノ博士編集

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Cheng、RYS、Ridnour、LA、Wink、AL 他。インターフェロンガンマは、予後不良につながる ER 乳房腫瘍における NOS2 および COX2 の発現に不可欠です。細胞死ディス 14、319 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 12 月 5 日

改訂日: 2023 年 4 月 20 日

受理日: 2023 年 4 月 24 日

公開日: 2023 年 5 月 11 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41419-023-05834-9

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供